沉默DNMT1基因?qū)olt-4細(xì)胞增殖、凋亡及組蛋白調(diào)控的影響

陳淑瑜，黃軼群，游育紅，馬旭東

( 1．漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系、2．福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科，福建漳州　363000; 3．福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州　350004)

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沉默DNMT1基因?qū)olt-4細(xì)胞增殖、凋亡及組蛋白調(diào)控的影響

陳淑瑜1，黃軼群2，游育紅3，馬旭東2

( 1．漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系、2．福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院血液科，福建漳州363000; 3．福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350004)

中國(guó)圖書分類號(hào): R329．24; R329．25; R341; R342．2; R394. 2; R733. 7

摘要:目的探討siRNA沉默DNMT1基因?qū)θ思毙訲淋巴細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞增殖、凋亡及組蛋白調(diào)控的影響。方法將DNMT1特異性siRNA經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞后，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Molt-4細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)Bcl-2、procaspase-3、P15蛋白表達(dá)以及組蛋白甲基化、乙?；癄顟B(tài)的改變。結(jié)果DNMT1 siRNA可沉默DNMT1基因的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性;抑制Molt-4細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)0、30、60、120 nmol·L－1DNMT1 siRNA作用24h后，細(xì)胞凋亡率分別為( 4. 27± 1. 42) %，( 15. 25±1. 54) %，( 35. 63±2. 54) %，( 66. 27± 3. 02) %，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。DNMT1 siRNA可上調(diào)P15的表達(dá);下調(diào)Bcl-2、procaspase-3的表達(dá)，下調(diào)組蛋白H3K9甲基化水平，上調(diào)組蛋白H3K4的甲基化水平，而組蛋白H3乙?；綗o(wú)明顯變化。結(jié)論DNMT1 siRNA可以有效地抑制Molt-4細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)，下調(diào)組蛋白H3K9甲基化水平，上調(diào)組蛋白H3K4的甲基化水平，從而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞:RNA干擾; DNMT1;組蛋白;乙?；?甲基化;急性白血病;表觀遺傳學(xué)

馬旭東( 1957－)，女，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向:血液腫瘤學(xué)，通訊作者，Tel: 0596-2082021，F(xiàn)ax: 0596-2593904，E-mail: maxudong005@ hotmail．com

DNA甲基化反應(yīng)是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶( DNMT)催化的，目前發(fā)現(xiàn)的DNMTs家族包括: DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B以及DNMT3L，其中DNMT1是一種持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，維持有絲分裂期DNA的甲基化狀態(tài)［1－2］。DNA甲基化不僅參與基因表達(dá)調(diào)控，而且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，是腫瘤常見表觀遺傳學(xué)改變之一［3］，DNMT成為一個(gè)重要的分子靶標(biāo)，在疾病的治療和預(yù)防中發(fā)揮重要作用［4］。有實(shí)驗(yàn)證明，在急性白血病患者和白血病細(xì)胞株中，DNMT基因異常高表達(dá)［5］。這些高表達(dá)的DNMT可能誘導(dǎo)某些相關(guān)基因，尤其是一些抑癌基因異常甲基化，最終可能導(dǎo)致白血病發(fā)生。因此，通過靶向性沉默DNMT1基因，重新啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

目前去甲基化治療已成為腫瘤誘導(dǎo)分化、抑制增殖的新方法，為探討靶向沉默DNMT1對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的作用，本研究通過人工化學(xué)合成針對(duì)DNMT1基因的siRNA片段，以LipofectamineTM2000為介導(dǎo)，靶向沉默Molt-4細(xì)胞DNMT1基因的表達(dá)，探討其對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖、凋亡以及對(duì)組蛋白調(diào)控的影響，研究白血病靶向基因治療。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱( 3111，美國(guó)Thermo公司)，低溫離心機(jī)( J2-21型Beckman公司)，常溫離心機(jī)(上海醫(yī)療器械公司)，倒置顯微鏡( Model-U-LH 100HG，日本OLYMPUS產(chǎn)品)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)( GeneGenius，英國(guó)Syngene公司)，UV2100紫外分光光度儀(上海譜析公司)，PCR擴(kuò)增儀( AG22331，德國(guó)Eppendorf公司)，迷你垂直電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司)，脫色搖床(北京東方儀器廠)。

1．2試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司) ; LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒及Opti-MEM試劑(美國(guó)Invitrogen公司) ; DNMT1 siRNA及PCR引物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司) ;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司) ;二甲基亞砜及MTT(濃度為5 g·L－1) (美國(guó)Sigma公司) ; BCA蛋白定量試劑盒( Thermo公司) ; β-actin、DNMT1、procaspase-3、BCL-2、P15單克隆抗體及Goat anti-mouse with HRP conjugate、Goat antirabbit with HRP conjugate二抗(美國(guó)Santa Cruz公司) ; Anti-acetyl-Histone H3、Anti-trimethyl-Histone H3 ( Lys9)、Anti-trimethyl-Histone H3 ( Lys4) (美國(guó)Upstate公司)。

1．3細(xì)胞培養(yǎng)取人類急性T淋巴細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1+鏈霉素100 kU·L－1的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．4Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)依據(jù)Reynolds等總結(jié)的設(shè)計(jì)siRNA原則，針對(duì)DNMT1區(qū)域選擇作用靶點(diǎn)的小干擾RNA片段，委托上海吉瑪公司合成。DNMT1 siRNA序列Sense 5'-GCACCU CAUUUGCCGAAUATT-3'，Antisense5'-UAUUCGGCA AAUGAGGUGCTT -3'，同時(shí)合成標(biāo)有熒光標(biāo)記的通用隨機(jī)陰性序列作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Molt-4細(xì)胞，懸浮于無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為( 8～16)×105。以LipofectamineTM2000為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟參照說明書。

1．5RT-PCR法檢測(cè)Molt-4細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt-4細(xì)胞，接種在6孔板上，DNMT1 siRNA濃度分別為0、30、60、120 nmol ·L－1，每孔總體積為2 mL。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，TRIzol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度法鑒定定量，A260/A280比值均在1. 8～2. 0之間，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反應(yīng)制備所得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)PCR引物序列如下: DNMT1上游引物: 5'-AGGTTGATGTCTGCGTGGTAGC-3'，下游引物5'-CCGAGTTGGTGATGGTGTGTAC-3';β-actin上游引物: 5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT-3'，下游引物5'-TCATGAAGTGTGACGTGGACATC-3'。PCR反應(yīng)條件:95℃5 min預(yù)變性，95℃45 s變性，49℃45 s退火，72℃45 s延伸，40個(gè)循環(huán)，72℃10 min再延伸。最后將PCR產(chǎn)物經(jīng)16 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠圖像分析儀上自動(dòng)分析成像。

1．6MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt-4細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，2×104個(gè)/孔，DNMT1 siRNA濃度分別為0、30、60、120 nmol· L－1。終體積為200 μL，每組設(shè)6個(gè)平行孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h取出一塊板，加5 g·L－1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，吸去上清，加入二甲基亞砜150 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)492 nm測(cè)吸光度( A 值)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率/% = ( A實(shí)驗(yàn)－A空白) / ( A對(duì)照－A空白)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1．7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡將Molt-4細(xì)胞懸液接種于6孔板上，終體積為2 mL，DNMT1 siRNA濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞。依據(jù)BD公司Annexin V和PI雙染試劑盒說明書進(jìn)行處理，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．8Western blot檢測(cè)DNMT1蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及組蛋白調(diào)控影響DNMT1 siRNA轉(zhuǎn)染24h后，收集上述各處理組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次后，按照1×106細(xì)胞加入100 μL裂解液和1 μL酶抑制劑的比例充分裂解細(xì)胞。于低溫( 4℃)下，12 000 r·min－1離心15 min后，收集蛋白，－20℃保存?zhèn)溆谩CA法進(jìn)行蛋白定量，取備用蛋白，以12% SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下水平搖床上緩慢搖動(dòng)，封閉1 h;放入TBS 1∶400稀釋的一抗中，4℃過夜。TBS洗滌液洗膜3次后，分別放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下水平搖床上緩慢搖動(dòng)1 h;洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線膠片掃描后，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用AlphaDigiDoc圖像分析軟件分析比較。

1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17. 0軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示。單變量?jī)山M資料比較采用t檢驗(yàn)，多組資料比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1DNMT1 siRNA對(duì)DNMT1 mRNA表達(dá)的影響DNMT1 siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞24 h后，提取mRNA進(jìn)行RT-PCR，與對(duì)照組比較可見，DNMT1 siRNA組的mRNA條帶亮度明顯減弱，而且隨著DNMT1 siRNA濃度的增加，亮度呈遞減趨勢(shì)，其中120 nmol·L－1組亮度減弱最明顯，表現(xiàn)出濃度依賴性( Fig 1)。0、30、60、120 nmol·L－1組DNMT1擴(kuò)增條帶灰度值與β-actin比值分別為: 0. 99±0. 18、0. 85±0. 15、0. 20±0. 07和0. 09±0. 01，與對(duì)照組相比，各處理組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。

Fig 1 Expression of DNMT1 mRNA in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

2．2 DNMT1 siRNA抑制Molt-4細(xì)胞增殖MTT法檢測(cè)DNMT1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖率的影響，經(jīng)0、30、60、120 nmol·L－1的DNMT1 siRNA作用24、48、72 h后，Molt-4細(xì)胞的增殖率變化見Tab 1。結(jié)果顯示，細(xì)胞的增殖率隨著DNMT1 siRNA濃度的增加而逐漸下降;而且隨著DNMT1 siRNA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖率逐漸下降，說明其作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性( Fig 2)，與對(duì)照組細(xì)胞增殖率相比，各處理組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。

Tab 1 Proliferation rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h，48h and 72h(±s)

Tab 1 Proliferation rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h，48h and 72h(±s)

*P＜0. 05 vs 0 nmol·L－1

Concentration/ nmol·L－1Proliferation rate/% 24 h　48 h　72 h 0 98．23±1．84　99．02±2．51　99．91±3．52 30　82．01±1．73*　72．03±2．73*　63．15±3．49*60　62．12±1．96*　54．76±1．86*　31．06±3．73*120　41．11±2．24*　34．23±3．54*　20．83±3．54*__

Fig 2 Proliferation rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24，48 and 72 h

2．3DNMT1 siRNA誘導(dǎo)Molt-4細(xì)胞凋亡經(jīng)DNMT1 siRNA作用24 h后，0、30、60、120 nmol· L－1siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為( 4. 27±1. 42) %、( 15. 25±1. 54) %、( 35. 63±2. 54) %、( 66. 27± 3. 02) %，結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率隨著siRNA濃度增加而逐漸上升，說明其作用具有濃度依賴性。DNMT1 siRNA組與對(duì)照組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)，見Fig 3。

2．4DNMT1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞P15、DNMT1表達(dá)的影響經(jīng)0、30、60、120 nmol·L－1DNMT1 siRNA作用Molt-4細(xì)胞24 h后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著DNMT1 siRNA濃度遞增，抑癌蛋白P15的表達(dá)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì);而DNMT1蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。AlphaDigiDoc圖像分析軟件分析比較，各組條帶灰度值與β-actin及對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)，見Fig 4。

Fig 3 Apoptotic rates of Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

Fig 4 Alteration of DNMT1，P15 protein in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

2．5 DNMT1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響經(jīng)上述不同濃度的DNMT1 siRNA處理Molt-4細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示:抗凋亡蛋白Bcl-2和胱天蛋白酶procaspase-3的表達(dá)量隨著DNMT1 siRNA濃度的增加而遞減，呈現(xiàn)濃度依賴性( P＜0. 05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( Fig 5)。

Fig 5 Alteration of apoptosis-related proteins in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

2．6DNMT1 siRNA對(duì)Molt-4細(xì)胞組蛋白調(diào)控的影響經(jīng)上述不同濃度的DNMT1 siRNA處理Molt-4細(xì)胞24 h后，H3K4甲基化水平隨siRNA處理濃度增加而表達(dá)逐漸增強(qiáng)，H3K9甲基化水平隨著siRNA處理濃度的增加而逐漸降低; P＜0. 05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而組蛋白H3乙?；轿匆娒黠@變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05)，見Fig 6。

3　討論

DNMT1是人體發(fā)育過程中必需的基因，定位于人類19pl3．2－19pl3．3，是人體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)且最為重要的甲基轉(zhuǎn)移酶［6］，主要維持DNA甲基化。DNMT1基因的高表達(dá)參與或影響惡性腫瘤的形成過程，啟動(dòng)子甲基化異常導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄失活是多種腫瘤發(fā)病的共同機(jī)制之一［7］。研究發(fā)現(xiàn):在胃癌、肝癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤臨床樣本中均檢測(cè)到DNMT1蛋白的高表達(dá)［8］，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑( DNMTis)對(duì)于治療基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化的癌癥有重要的意義［9］。因此，本研究通過DNMT1 siRNA降低DNMT1基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制基因的高甲基化狀態(tài)，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

Fig 6 Alteration of histone-related proteins in Molt-4 cells after transfection with DNMT1 siRNA for 24 h

Kurita等［10］構(gòu)建DNMT1 siRNA及DNMT3b siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)siRNA抑制肝癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究顯示: Molt-4細(xì)胞經(jīng)不同濃度的DNMT1 siRNA作用后，增殖率逐漸下降，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性和濃度依賴性，說明DNMT1 siRNA可阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。研究還發(fā)現(xiàn): DNMT1 siRNA可上調(diào)抑癌蛋白P15表達(dá)。p15基因作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，如果p15基因失活，則P15蛋白不能正常表達(dá)，細(xì)胞增殖失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。p15基因缺失、突變、失活等在惡性血液病中容易發(fā)生，而且p15基因甲基化與血液病的療效及預(yù)后也有關(guān)系［11］。本研究采用的急性T淋巴細(xì)胞性白血病Molt-4細(xì)胞株，其p15基因高度甲基化，p15基因弱表達(dá)，對(duì)正常細(xì)胞周期不能發(fā)揮負(fù)性調(diào)控功能，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)周期失調(diào)，細(xì)胞癌變。通過轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA，上調(diào)p15基因和P15蛋白的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究顯示，DNMT1 siRNA可誘導(dǎo)Molt-4細(xì)胞凋亡，隨著DNMT1 siRNA濃度增加，Molt-4細(xì)胞凋亡率逐漸增高;同時(shí)procaspase-3及Bcl-2表達(dá)量逐漸遞減，具有明顯的濃度依賴性。推測(cè)沉默DNMT1可通過線粒體介導(dǎo)的通路(內(nèi)在通路)發(fā)揮對(duì)Molt-4細(xì)胞株凋亡的調(diào)控，Bcl-2家族中促凋亡蛋白，誘發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞質(zhì)，激活caspase-9前體，活化的caspase-9繼而激活下游的caspase-3，引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡通路。亦不排除受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路參與的凋亡過程，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究通過DNMT1 siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細(xì)胞，結(jié)果p15基因表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，推測(cè)DNMT1 siRNA通過增加p15基因表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控過程。

本研究發(fā)現(xiàn): DNMT1 siRNA可下調(diào)組蛋白H3K9甲基化水平，上調(diào)組蛋白H3K4的甲基化水平。DNMT1 siRNA抑制H3K9甲基化，解除對(duì)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而使p15基因轉(zhuǎn)錄活性增加、表達(dá)水平增加，發(fā)揮細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控作用促使細(xì)胞周期停滯; Bcl-2表達(dá)水平下降，啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的通路，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。DNMT1 siRNA干擾DNMT1基因表達(dá)，H3K4甲基化水平升高，說明在基因沉默機(jī)制中，H3K9甲基化與DNA甲基化正相關(guān)，而H3K4甲基化與DNA甲基化負(fù)相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。由此可見，DNA甲基化與組蛋白修飾之間存在密切的聯(lián)系，DNMT1的N端與HDAC1、HDAC2結(jié)合，引起組蛋白去乙?；?亦可招募賴氨酸特異性脫甲基酶1 ( LSDl)和組蛋白甲基化酶Suv39hl，導(dǎo)致組蛋白不同的氨基酸去甲基化或甲基化。另外，組蛋白低乙?；癄顟B(tài)促進(jìn)DNA甲基化，而組蛋白高乙?；癄顟B(tài)抑制DNA甲基化［12］。有研究報(bào)道: DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’脫氧胞苷能改變組蛋白乙?；癄顟B(tài)［13］，而本研究顯示轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA后，組蛋白H3乙?；綗o(wú)明顯變化，因此推測(cè)在DNA甲基化與組蛋白乙?；嗷ブg的調(diào)控可能存在多樣性。

本研究證實(shí)采用RNA干擾技術(shù)沉默DNMT1基因后，通過調(diào)控組蛋白的甲基化，重新啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)p15基因表達(dá)，裂解Bcl-2，激活caspase-3，啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，在今后臨床治療中，有望通過siRNA沉默DNMT1基因，發(fā)揮抑癌作用，成為癌癥基因治療的有效手段。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持。)

參考文獻(xiàn):

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Effect of Silencing DNMT1 gene on histone methylation modulation，cell proliferation and apoptosis in Molt-4 cell line

CHEN Shu-yu1，HUANG Yi-qun2，YOU Yu-hong3，MA Xu-dong2
( 1．Dept of Pharmacy，Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou Fujian 363000，China; 2．Dpet of Hematology，Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou Fujian 363000，China; 3．School of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of small interfering RNA( siRNA) targeting DNMT1 gene on cell proliferation，apoptosis and histone modulation in acute lymphoid leukemia cell line，Molt-4．Methods The small interfering RNA targeting DNMT1 gene was transfected into Molt-4 cells by LipofectamineTM2000．The DNMT1 mRNA and protein level were detected by RT-PCR and Western blot．Cell proliferation was determined by MTT．Cell apoptosis was measured by Flow Cytometry．The expression of Bcl-2，procaspase-3，P15，histone methylation and histone acetylation was detected by Western blot．Results DNMT1 was suppressed by siRNA targeting DNMT1 in a concentration-dependent manner．DNMT1 siRNA suppressed cells proliferation and induced apoptosis in Molt-4 cells．Apoptotic rate was ( 4. 27±1. 42) %，( 15. 25 ±1. 54) %，( 35. 63±2. 54) %，( 66. 27±3. 02) % after transfecting with DNMT1 siRNA at 0，30，60，120 nmol·L－1for 24 hours，P＜0. 05．The expression of Bcl-2，procaspase-3 was suppressed and P15 was promoted after transfecting of DNMT1 siRNA．DNMT1 siRNA downregulated histone methylated H3K9 and upregulated histone methylated H3K4．The alteration of histone acetylation of H3 was not seen．Conclusion DNMT1 siRNA suppresses DNMT1 efficiently in Molt-4 cells．The depletion of DNMT1 downregulates histone methylation of H3K9，and upregulates histone methylation of H3K4．It inhibits cell growth and induces cell apoptosis in Molt-4 cell line．

Key words:RNA interference; DNMT1; histone; acetylation; methylation; acute leukemia; epigenetics

作者簡(jiǎn)介:陳淑瑜( 1972－)，女，碩士，副教授，研究方向:藥理學(xué)，Tel: 0596-2559522，E-mail: csy6688@126．com;

基金項(xiàng)目:福建省引進(jìn)重大項(xiàng)目計(jì)劃基金( No 2012I2004) ;福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 2012J01420) ;福建醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(重點(diǎn)類) ( No 2013FZS 13004Z) ;福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題( No 2012-CX-32) ;福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目( No JB13364)

收稿日期:2015－09－06，修回日期: 2015－11－24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0064－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．014