青蒿琥酯對人大腸癌Lovo細胞侵襲影響的初步研究

郭　穎，郭建華，符　航，田芝瑜，羅　強，劉　芳，張林西

( 1．河北北方學(xué)院病理教研室，河北張家口　075000;2．張家口市宣化皇城醫(yī)院功能科，河北宣化　075100; 3．河北北方學(xué)院，河北張家口　075000;4．河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口　075000)

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青蒿琥酯對人大腸癌Lovo細胞侵襲影響的初步研究

郭穎1，郭建華2，符航3，田芝瑜3，羅強4，劉芳4，張林西4

( 1．河北北方學(xué)院病理教研室，河北張家口075000;2．張家口市宣化皇城醫(yī)院功能科，河北宣化075100; 3．河北北方學(xué)院，河北張家口075000;4．河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口075000)

中國圖書分類號: R284．1; R329．24; R735．340．22; R977. 6

摘要:目的觀察青蒿琥酯對大腸癌細胞的侵襲作用，并探討其作用機制。方法采用不同濃度的青蒿琥酯( 20、80、160 μmol·L－1)作用于人大腸癌Lovo細胞，軟瓊脂集落形成實驗檢測青蒿琥酯對Lovo細胞錨著不依賴性增殖的影響; Transwell侵襲實驗檢測其對Lovo細胞侵襲的影響; Western blot方法分別檢測Lovo細胞內(nèi)HMGB1和MMP-2蛋白質(zhì)水平的表達情況。結(jié)果青蒿琥酯能有效抑制Lovo細胞的增殖和侵襲能力，且呈劑量依賴性( P＜0. 01)。與對照組相比，不同濃度青蒿琥酯處理組HMGB1和MMP-2蛋白表達逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 05)。結(jié)論青蒿琥酯可明顯抑制大腸癌Lovo細胞侵襲，其機制可能與抑制HMGB1蛋白，下調(diào)MMP-2表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:青蒿琥酯;大腸癌;增殖;侵襲; HMGB1;MMP-2

青蒿琥酯( artesunate，ART)作為一種高效、低毒的抗瘧藥已廣為人知，近來又有研究發(fā)現(xiàn)，ART還有抗腫瘤功效，但其作用機制尚未明確。而侵襲和轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的主要原因，近年研究發(fā)現(xiàn)，包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高遷移率族蛋白( high mobility group protein，HMG蛋白)過表達，有可能通過激活下游基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)來促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本實驗通過ART干預(yù)大腸癌Lovo細胞，觀察對細胞侵襲能力的影響，并檢測細胞內(nèi)HMGB1和侵襲遷移相關(guān)基因MMP-2表達情況，來探討其作用機制。

1　材料與方法

1．1主要材料人大腸癌Lovo細胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞資源中心，青蒿琥酯購于桂林南藥股份有限公司(批號H10930195)。培養(yǎng)基F12K購于Sigma公司; BCA蛋白分析試劑盒購于Pierce公司; Transwell小室購于Coster公司;基底膜膠( Matrigel)購于BD公司; HMGB1抗體、MMP-2抗體、β-actin抗體均購于Santa Cruz公司。

1．2方法

1．2．1細胞培養(yǎng)人大腸癌Lovo細胞株采用F12K培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于含5% CO2的37℃溫箱中，待細胞進入對數(shù)生長期后，用不同濃度( 20、80、160 μmol·L－1)的青蒿琥酯處理Lovo細胞，不加藥物組為陰性對照，進行以下實驗。

1．2．2軟瓊脂集落形成實驗參照文獻方法［1］，取對數(shù)生長期的各組細胞5 000個，接種于含下層5 g·L－1瓊脂糖和上層3. 5 g·L－1瓊脂糖的6孔板中，37℃和5% CO2實驗條件下培養(yǎng)14 d后，倒置相差顯微鏡下計數(shù)大于10個細胞的集落數(shù)，并計算細胞集落抑制率。集落抑制率/% = ( 1－給藥組集落數(shù)/對照組集落數(shù))×100%

1．2．3 Transwell小室侵襲實驗參照文獻方法［2］進行以下實驗。Transwell小室的上室底部為孔徑8 μm的聚碳酸酯膜，膜上鋪勻1∶4稀釋的基底膜膠( matrigel)。下室加預(yù)先制備的Lovo細胞培養(yǎng)上清液600 μL，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液，然后按照1×105個細胞的密度在上室加入ART ( 20、80、160 μmol·L－1)處理后的細胞懸液30 μL，每組4個復(fù)孔。37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，取出濾膜，用棉簽擦盡膜上Matrigel及未穿過的細胞，甲醇固定5 min，HE染色。光鏡200倍，隨機計數(shù)5個視野的穿膜細胞數(shù)，取每個視野的平均數(shù)表示腫瘤細胞侵襲能力。

1．2．4 HMGB1和MMP-2蛋白水平檢測提取各組Lovo細胞總蛋白，對蛋白定量后進行常規(guī)Western blot法檢測各組蛋白水平，與內(nèi)參照β-actin的測定結(jié)果相對比，利用Kodak Digital Science ID Image Analysis Software ( Eastman Kodak Company，USA)測定各條帶凈灰度值。

1．2．5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。對計量單位，用±s表示，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析( one way ANOVA)。

2　結(jié)果

2．1青蒿琥酯對大腸癌Lovo細胞軟瓊脂集落形成的影響人大腸癌Lovo細胞可自發(fā)形成集落。經(jīng)青蒿琥酯處理48 h后發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理組( 20 μmol·L－1)即出現(xiàn)Lovo細胞集落生成減少;與對照組相比，青蒿琥酯由低到高濃度處理組集落形成抑制率分別為( 38. 01±5. 12) %、( 53. 05±2. 92) %和( 69. 37±1. 84) %，呈劑量依賴性( P＜0. 01，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Influence of soft-agar colony formation of the artesunate on Lovo cells ( n =5)

2．2青蒿琥酯對大腸癌Lovo細胞侵襲的影響與對照組比較，隨青蒿琥酯濃度增高，Lovo細胞穿過濾過膜的細胞數(shù)分別為30. 33±2. 52、15. 67± 1. 53，8. 00±1. 00，呈明顯下降趨勢，與對照組( 47. 00±2. 00)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 01，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 Effect of artesunate on invasion of Lovo cells detected by Matrigel contained transwell chamber assay ( n =5)

2．3青蒿琥酯對Lovo細胞HMGB1和MMP-2蛋白表達的影響青蒿琥酯處理細胞后，于48 h收集細胞，進行Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，處理組HMGB1和MMP-2蛋白水平均隨濃度升高而降低( Tab 1，F(xiàn)ig 3)。

Tab 1 Expressions of HMGB1 and MMP2 in Lovo cells treated with different concentrations of artesunate( n =3)

Fig 3 Effects of artesunate on expression of HMGB1 and MMP-2 in Lovo cells

3　討論

ART作為一種中藥提取成分，廣泛應(yīng)用于抗瘧治療，近幾年，人們發(fā)現(xiàn)它也有抗腫瘤功效，但對腫瘤的抑制作用研究仍不深入。大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，20%的患者在診斷時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，另外早期診斷為大腸癌的患者，有半數(shù)最終也發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移［3］，所以控制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移刻不容緩。大多數(shù)正常的真核細胞(除成熟紅細胞外)，只有黏附在特定的細胞外基質(zhì)上才能存活，稱為錨著依賴性( anchorage dependence)。而腫瘤細胞其惡性程度可以利用其錨著不依賴性檢測腫瘤細胞的主動移動能力。軟瓊脂中的克隆形成率則反映細胞的群體依賴性和增殖能力，是反映腫瘤細胞的惡性度的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，軟瓊脂形成集落的多少與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)［4］。癌細胞侵襲能力越強，軟瓊脂上形成的集落數(shù)目越多且集落體積越大［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌細胞經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯處理后，軟瓊脂集落數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性( P＜0. 01)，提示青蒿琥酯可在某種程度上抑制大腸癌細胞的惡性增殖能力。

腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是通過侵襲細胞外基質(zhì)來實現(xiàn)［6］。目前常用的基質(zhì)膠matrigel主要成分由層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，與細胞外基質(zhì)的成分非常相近，能有效地模擬腫瘤細胞在體外的侵襲過程。黃偉煒等［7］以人結(jié)腸癌細胞HCT-8為模型，采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可明顯抑制結(jié)腸癌HCT-8細胞的侵襲，其抑制作用與減少腫瘤新生血管有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌Lovo細胞有較強的侵襲能力，而經(jīng)過青蒿琥酯處理后，穿過聚碳酸脂膜的細胞數(shù)呈濃度依賴性減少( P＜0. 01)，提示青蒿琥酯可抑制大腸癌細胞的侵襲能力，本研究進一步從降解細胞外基質(zhì)的途徑探討青蒿琥酯侵襲抑制機制。

基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分，在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中占重要位置［8］。其中MMP-2是該家族的重要成員之一，在許多腫瘤如肝細胞癌［9］、子宮內(nèi)膜癌［10］、肺癌［11］、結(jié)腸癌［12］、胃癌［13］等組織中過表達，而在正常組織中表達很低或不表達也得到證實。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MMP-2基因作為腫瘤標志物，與某些癌細胞侵襲有關(guān)，在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后發(fā)揮作用［14］。高遷移率族蛋白B1 ( high mobility group protein B1，HMGB1)因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移率而得名。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1通過與晚期PAGE結(jié)合，激活MAPK、p38、JNK等信號通路，引起MMPs等腫瘤相關(guān)因子的激活［15］，降解細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強與HMGB1的高表達密切相關(guān)［16］。本研究以不同濃度青蒿琥酯處理大腸癌Lovo細胞后，應(yīng)用Western blot法檢測HMGB1和MMP-2蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理組HMGB1和MMP-2蛋白水平均明顯下調(diào)，提示青蒿琥酯影響HMGB1與相應(yīng)受體結(jié)合，抑制細胞核外的相關(guān)信號通路，導(dǎo)致MMP-2表達下降，阻礙細胞外基質(zhì)的降解，減少細胞向遠處侵襲轉(zhuǎn)移的可能性。

綜上所述，青蒿琥酯在體外培養(yǎng)中證實能抑制大腸癌細胞增殖和侵襲，有可能成為一個有較好前景的抗腫瘤中成藥，其抑制侵襲作用通過何種信號通路仍有待進一步研究。

(致謝:本文實驗在河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心完成。)

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Preliminary of research of effect of artesunate on invasion of human colon cancer Lovo cells

GUO Ying1，GUO Jian-hua2，F(xiàn)U Hang3，TIAN Zhi-yu3，LUO Qiang4，LIU Fang4，ZHANG Lin-xi4
( 1. Dept of Pathology，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China; 2. Dept of Function，Huangcheng Hospital，Zhangjiakou，Hebei 075100，China; 3. Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China; 4. Experiment center，Heber North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of artesunate on the invasion of human colon cancer Lovo cells and the possible mechanisms．Methods After Lovo cells were treated with different doses of artesunate( 20，80，160 μmol·L－1)，the soft agar colony formation test was adopted to observe the anchorage-independent proliferation of Lovo cells．Transwell assay was used to determine the effect of artesunate on the invasion ability of Lovo cells．And the protein expressions of HMGB1 and MMP-2 were investigated by western blot．ResultsArtesunate could significantly inhibit both proliferation and invasion ability of Lovo cells in a dose-dependent manner( P＜0. 01)．The experimental group treated with artesunate significantly down-regulated the protein expressions of HMGB1 and MMP-2 compared with control group( P＜0. 05)．Conclusion Artesunate could inhibit the invasion of human colon cancer Lovo cells by down-regulating HMGB1 and MMP-2 expressions．

Key words:artesunate; colon cancer; proliferation; invasion; HMGB1; MMP-2

作者簡介:郭穎( 1982－)，女，碩士，講師，研究方向:消化道腫瘤病理學(xué)，通訊作者，Tel: 0313-4029293，E-mail: guoyingguo2008@163．com

基金項目:河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金項目( No QN20131078) ;河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目( No ZD20131004)

收稿日期:2015－10－14，修回日期: 2015－11－15

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0060－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．013