牛奶中甲氧芐啶膠體金快速檢測裝置的研制

李曉娜，李君秀，付 輝，楊星星，李細清，汪鳳林，楊 中，朱 海，嚴義勇*

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518000)

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牛奶中甲氧芐啶膠體金快速檢測裝置的研制

李曉娜1，2，李君秀1，付 輝1，楊星星1，李細清1，汪鳳林1，楊 中1，朱 海1，嚴義勇1*

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518000)

摘要[目的]研究牛奶中甲氧芐啶的膠體金快速檢測裝置，快速篩查牛奶中甲氧芐啶添加物含量并評價牛奶品質(zhì)。[方法]制備抗原，免疫得到抗體并摸索膠體金免疫層析裝置的樣品檢測性能。[結(jié)果]試驗所得裝置對牛奶中甲氧芐啶的肉眼可見檢測線為2 ng/L，假陽性率為0%，假陰性率為0%；與常見3種混合添加物無交叉反應(yīng)，特異性高；不同批次間結(jié)果重復(fù)性高度一致；穩(wěn)定性好，易于保存，在37 ℃條件可存放35 d，50 ℃存放6 d對其質(zhì)量無影響；兼容性好，適合6種不同種類奶基質(zhì)；檢測時間短，僅需6 min。[結(jié)論]該研究的裝置檢測時間短，使用簡單，重復(fù)性好，產(chǎn)品穩(wěn)定性高，適用于牛奶中甲氧芐啶的現(xiàn)場快速篩查和檢測。

關(guān)鍵詞牛奶；甲氧芐啶；膠體金；快速檢測

甲氧芐啶是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑[1]，其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但抗菌作用較磺胺類藥物強，對大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭氏陽性和陰性細菌有效，但對綠膿桿菌感染無效，最低抑菌濃度常低于10 mg/L。甲氧芐啶單用易引起細菌耐藥性，故一般不單獨使用，主要與磺胺類藥組成復(fù)方制劑，因此它又被稱為磺胺增效劑，用于擴大抗菌譜，增強抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等，可與長效磺胺類藥合用于耐藥惡性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上不合理的使用甚至濫用，抗菌增效劑類藥物在動物源性食品中的殘留會不可避免地發(fā)生。人類長期食用含有甲氧芐啶殘留的動物源性食品及其制品，將有可能對健康產(chǎn)生危害。因此為了加強對動物源性食品中此類藥物的監(jiān)控，建立一種準(zhǔn)確、快速、方便的甲氧芐啶殘留量檢測方法很有必要。

目前，國內(nèi)外檢測甲氧芐啶的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MASS)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[2-4]。在食品安全檢測中，往往先用ELISA初篩后再對陽性樣本用HPLC或LC-MASS進行確證。上述方法中所用儀器設(shè)備復(fù)雜、成本高、對操作人員技術(shù)要求高且不能立即顯示結(jié)果，不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對懷疑對象進行快速地在線檢測和監(jiān)控，因此筆者研制出一種能快速檢測牛奶中甲氧芐啶的裝置。

1材料與方法

1.1材料檢測用牛奶樣品購自當(dāng)?shù)爻?。氯金酸、檸檬酸鈉、甲醇等化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；卵清蛋白、牛血清蛋白購自生工集團；甲氧芐啶購自sigma公司；硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊及反應(yīng)杯購自上海必泰生物科技；所用純水為出自純化系統(tǒng)的電阻為18.2 mΩ的超純水。磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；數(shù)控切條機、點模儀，杭州格倫坤科技有限公司；真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原制備。在100 mL的三頸瓶中依次加入2.5 g甲氧芐啶，30 mL 48%氫溴酸，100 ℃反應(yīng)30 min，然后加入50%氫氧化鈉溶液6 mL淬滅。冷卻析出晶體后，將晶體溶解于20 mL沸水，隨后加入濃氨水調(diào)節(jié)pH至7，重結(jié)晶提純。

取上一步晶體0.5 g溶于10 mL DMF中，加入碳酸鉀0.5 g，及0.43 mL溴丙酸，40 ℃反應(yīng)6 h。乙酸乙酯萃取過柱提純得甲氧芐啶半抗原。

1.2.2免疫抗原制備。利用甲氧芐啶半抗原制備免疫抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清液為A液，稱取卵清蛋白(OVA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應(yīng) 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.3包被抗原的制備。利用甲氧芐啶半抗原制備包被抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清液為A液，稱取牛血清蛋白(BSA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應(yīng) 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.4膠體金的制備。取純水100 mL，加入1 mL 1% (m/V)的氯金酸溶液，攪拌均勻并加熱至沸騰，迅速加入2.4 mL 1%(m/V)檸檬酸鈉水溶液，攪拌均勻并繼續(xù)加熱至沸騰，至液體變?yōu)榫萍t色停止加熱。冷卻至室溫，并補充水至100 mL，得到膠體金溶液。

1.2.5甲氧芐啶單克隆抗體的制備。利用甲氧芐啶免疫抗原制備單克隆抗體。使用甲氧芐啶免疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強免疫3次后，采血測效價，待血清效價不再上升，用2倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，3 d后脫頸致死小鼠，在無菌條件下取脾臟制備脾細胞，與生長旺盛的小鼠骨髓瘤細胞按8∶1的比例混合于50 mL離心管，加入30 mL無血清IPMI1640培養(yǎng)基，1 100 r/min離心5 min后棄上清，將細胞團輕輕振松，置于37 ℃水浴中。將1 mL 50%PEG-4000緩緩加入細胞中，在1 min內(nèi)滴完，同時輕輕攪動底部沉淀，靜置1 min后，前30 s沿管壁緩慢勻速加入無血清培養(yǎng)基 1 mL，后30 s加入2 mL，然后快速加入27 mL終止融合過程，1 100 r/min離心5 min，棄上清，用HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后加到已鋪有飼養(yǎng)細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)。7 d后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細胞數(shù)量達到300個以上時，用間接ELISA法篩選，選擇強陽性、抑制效果好、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測，均呈陽性的孔內(nèi)細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)以備單克隆抗體的制備。

采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)抗甲氧芐啶單克隆抗體。選4只經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠，腹腔注射液體石蠟油 0.5 mL/只，7 d后腹腔注射雜交瘤細胞(3～5)×106/只，10 d后，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水，經(jīng)紫外測定抗甲氧芐啶單克隆抗體的含量。

1.2.6膠體金標(biāo)記抗體。調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.0，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時逐滴加入甲氧芐啶的單克隆抗體，1 h后加入抗體量相當(dāng)?shù)腜EG，充分反應(yīng)30 min后加入抗體量相當(dāng)?shù)腂SA，加完后，繼續(xù)攪拌30 min。在9 000 r/min下離心30 min獲得均一性金標(biāo)抗體沉淀，再加PNPB重懸備用。

1.2.7膠體金快速檢測裝置的組裝。在底板上，沿同一方向依次將樣品墊、噴涂有甲氧芐啶-BSA(檢測線)和兔抗鼠IgG(質(zhì)控線)的硝酸纖維素膜及吸水紙依次搭接粘連；反應(yīng)杯內(nèi)加入膠體金標(biāo)記抗體，凍干。裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2.8檢測方法。取200 μL奶樣品于微孔中混勻，(40±2)℃溫育3 min，插入試紙條，(40±2)℃溫育3 min后進行結(jié)果判讀。

1.2.9檢測裝置的性能測定。

1.2.9.1檢測限、假陽性率、假陰性率。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為0、1、2、3、4、5、10、15 ng/L，每個濃度重復(fù)5次，樣品處理后用檢測裝置檢測，判定檢測限、假陽性率及假陰性率。

1.2.9.2特異性。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為2 ng/L，其他藥物添加為20 ng/L，每個濃度重復(fù)5次，樣品處理后用檢測裝置檢測，判定其特異性。

1.2.9.3重復(fù)性。分別取3個不同批次的牛奶樣品，使用檢測裝置進行檢測，判斷其重復(fù)性。

1.2.9.4兼容性。分別取不同性質(zhì)奶品，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0及2 ng/L，使用檢測裝置進行檢測，判斷其樣品適用性。

1.2.9.5穩(wěn)定性。將產(chǎn)品分別置于37及50 ℃環(huán)境，隔一定天數(shù)取出裝置進行檢測，判斷其穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1檢測限、假陽性率及假陰性率檢測裝置濃度設(shè)置如表1所示，試驗結(jié)果見圖2。當(dāng)添加甲基芐胺濃度為0～1ng/L時，檢測線(T)顏色較對照線(C)深，結(jié)果為陰性；當(dāng)添加量為2 ng/L時，T線顏色與C線相當(dāng)，結(jié)果為弱陽性；當(dāng)添加量為3～15 ng/L時，T線顏色遠弱于C線，此時為強陽性結(jié)果。因此，該試紙條的檢測限為3 ng/L，假陽性率及假陰性率均為0%。

注：“-”表示檢測結(jié)果為陰性，“+”表示檢測結(jié)果為陽性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

2.2特異性與常見藥物進行交叉反應(yīng)率的測定，結(jié)果如表2。當(dāng)加入10倍量常見藥物時，對其檢測效果無明顯影響，因此該檢測裝置對甲氧芐啶具有較高的特異性。

2.3重復(fù)性分別購買3批牛奶樣品，每批次取10個樣品，分別為陰性樣本及2 ng/L添加，進行重復(fù)性檢測。結(jié)果如表3所示，在不同批次的牛奶樣品中，檢測結(jié)果一致。因此，該檢測裝置具有較好的重復(fù)性。

2.4兼容性由表4可見，檢測裝置對不同的奶品均表現(xiàn)出優(yōu)良的檢測性能，具有優(yōu)良的兼容性。

2.5穩(wěn)定性檢測裝置分別置于37及50 ℃條件下，對其檢測性能進行跟蹤。在不同時間抽取裝置對樣品進行檢測，每次檢驗陰性及陽性樣品各5個。由表5可見，該裝置檢測穩(wěn)定性高，在37 ℃條件下可存放35 d，在50 ℃條件下存放6 d對其質(zhì)量無影響。

注：“-”表示檢測結(jié)果為陰性，“+”表示檢測結(jié)果為陽性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

表3不同批次奶樣品甲氧芐啶重復(fù)性檢測結(jié)果

Table 3Repeatable detection results of trimethoprim in different batches of milk

注：“-”表示檢測結(jié)果為陰性，“+”表示檢測結(jié)果為陽性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

表4不同奶樣品甲氧芐啶重復(fù)性檢測結(jié)果

Table 4Repeatable detection results of trimethoprim in different milk samples

注：“-”表示檢測結(jié)果為陰性，“+”表示檢測結(jié)果為陽性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

注：“-”表示檢測結(jié)果為陰性，“+”表示檢測結(jié)果為陽性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

3結(jié)論與討論

該研究基于膠體金免疫層析原理開發(fā)了一種快速檢測牛奶中甲氧芐啶的檢測裝置。該裝置對牛奶中甲氧芐啶的

檢測限達到2 ng/L，檢測時間僅需6 min，而且對甲氧芐啶的特異性較高，添加10倍量的磺胺嘧啶、氯霉素及四環(huán)素藥物對檢測結(jié)果無影響。此外，該裝置重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，易于保存，在37 ℃條件可存放35 d，50 ℃存放6 d對其質(zhì)量無影響。

隨著生活水平的提高，人們對食品安全的要求也越來越高，甲氧芐啶作為一種抗菌增效劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，其殘留對人類健康可能造成危害，因此對其進行監(jiān)測具有重要意義。該試驗研發(fā)的甲氧芐啶快速檢測裝置，較傳統(tǒng)的質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法具有成本、操作難度、時間及便捷性上的極大優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于牛奶甲氧芐啶的現(xiàn)場篩查和檢測，具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。

參考文獻

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Development of a Rapid Detection System for Trimethoprim in Milk

LI Xiao-na1,2, LI Jun-xiu1, FU Hui1, YAN Yi-yong1*

(1. Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, Guangdong 518000; 2. Shenzhen Total-Test Technology Co., Ltd., Shenzhen, Guangdong 518000)

Key wordsMilk; Trimethoprim; Colloid gold; Rapid detection

Abstract[Objective] To research a rapid detection system for trimethoprim in milk, and to provide methods for the rapid screening of milk quality and the trimethoprim content in milk. [Method] Antigen was prepared. Antibody was obtained through immunity. Sample detection performance of colloidal gold immunochromatography system was found out. [Result] This system had a detection limit as low as 2 ng/L，and the false positive rate and false negative rate were both 0%. There was no cross reaction with common three mixed additives with high specificity. Result of repeatability in different batches was highly consistent. This system had high stability and was easy to preserve. The quality was not affected when milk was stored at 37 ℃ for 35 d or 50 ℃ for 6 d. [Conclusion] This system has short detection time, is simple, repeatable and stable, and is suitable for the rapid screening and detection of trimethoprim in milk.

基金項目深圳市科技創(chuàng)新委員會深圳市生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目(GCZX20140509163151273)；廣東省科學(xué)技術(shù)廳促進科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計劃項目(2013B040402001)。

作者簡介李曉娜(1988- )，女，廣東揭陽人，從事食品檢測和分子生物學(xué)檢測研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事化學(xué)生物學(xué)研究。

收稿日期2015-12-16

中圖分類號S 851.34+7

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-063-03