正交試驗(yàn)法優(yōu)化蓮子殼中原花青素的提取工藝

童錫迪，彭紅（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

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正交試驗(yàn)法優(yōu)化蓮子殼中原花青素的提取工藝

童錫迪，彭紅*
（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

摘要：試驗(yàn)優(yōu)選了蓮子殼中原花青素的最佳提取工藝。以原花青素的提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4因素對(duì)原花青素提取率的影響，優(yōu)選其最佳提取條件。結(jié)果表明，優(yōu)選出的最佳提取工藝為：提取溶劑50 %乙醇，料液比1∶10（g/mL），提取溫度65℃，提取時(shí)間3 h。該提取工藝操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：蓮子殼；原花青素；提取工藝；正交試驗(yàn)

原花青素是不同數(shù)量的黃烷-3-醇或黃烷-3，4-二醇聚合而成的聚合物的總稱[1]，是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，具有較強(qiáng)的消除自由基能力和改善人體微環(huán)境的多重功能。因其具有良好的抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤、抗誘變等生物活性[2-10]，現(xiàn)已被廣泛用于醫(yī)藥、保健品、食品及化妝品等領(lǐng)域。目前，研究較多的是從葡萄籽、山楂、玫瑰花、金蕎麥、虎杖等中提取原花青素，本研究發(fā)現(xiàn)蓮子殼中亦含有原花青素，首次以蓮子殼作為原料，從中提取原花青素，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)法優(yōu)化原花青素的提取工藝。蓮子殼為睡蓮科植物蓮的干燥成熟種子的果皮，蓮子殼作為蓮的副產(chǎn)物，資源十分豐富，但在加工過(guò)程中，多數(shù)蓮子殼被丟棄，資源未被充分利用，故從蓮子殼中提取原花青素屬于廢物再利用，具有較大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1材料與儀器

蓮子殼：廣昌縣白蓮科學(xué)研究所；葡萄籽提取物：陜西太極華青科技有限公司，純度>95 %。

Agilent 1200高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）；電子天平：北京賽多利斯電子儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；KQ2200超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；甲醇、乙腈、異丙醇為色譜純，水為三蒸水，其余試劑為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蓮子殼原花青素最佳提取條件的確定

選取不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（30 %～70 %）、料液比1∶4（g/mL）～1∶12（g/mL）、提取溫度40℃～80℃和提取時(shí)間0.5 h～4 h，以原花青素的提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取條件。

1.2.2原花青素的測(cè)定方法

1.2.2.1測(cè)定原理

蓮子殼中的原花青素能在熱酸性條件下可醇解產(chǎn)生花色素，利用花色素的還原性在鐵鹽的催化反應(yīng)下產(chǎn)生特征性的紅色，并且在可見(jiàn)光區(qū)有一特征吸收峰，最大吸收峰波長(zhǎng)為525 nm，其顯色靈敏而穩(wěn)定。

1.2.2.2色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），檢測(cè)器為DAD檢測(cè)器，采用甲醇-水-甲酸-異丙醇（13∶73∶8∶6）為流動(dòng)相；流速為1 mL/min；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為525 nm；進(jìn)樣量10 μL。見(jiàn)圖1。

圖1原花青素對(duì)照品（A）、蓮子殼提取物樣品（B）Fig.1 Proanthocyanidins reference substance（A），Lotus seed shell extractions（B）

1.2.2.3試驗(yàn)測(cè)定

將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，取出15 mL置于具塞錐形瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液（2 %硫酸鐵銨溶液：稱取硫酸鐵銨2 g，用濃度為2 mol/L的鹽酸溶解，定容至100 mL）和2 mL試樣溶液，混勻，置沸水浴中回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，待進(jìn)高效液相色譜分析。

1.2.2.4溶液制備

供試品溶液的制備：將蓮子殼提取液定容至適當(dāng)體積，精密量取1 mL置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，按1.2.2.3項(xiàng)下試樣測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：稱取原花青素對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。從中精密量取1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，按1.3.2.3項(xiàng)下試驗(yàn)測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)，即得對(duì)照品溶液。

1.2.2.5線性關(guān)系考察

分別精密量取原花青素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.5、1 .0、1.5、2.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，按1.3.2.3項(xiàng)下試樣測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 1.547 4x-17.02 3，R2=0.999 5，x為濃度，y為峰面積。在濃度37.6 μg/mL～300.8 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2結(jié)果與討論

2.1提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

原花青素易溶于水，也易溶于甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃等有機(jī)溶劑，考慮到原花青素作為保健品食用，因此試驗(yàn)選取乙醇溶液作為提取劑，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effects of alcohol concentration on the extraction yield of proanthocyanidins

由圖1可以看到，在料液比1∶10（g/mL），提取溫度65℃，提取時(shí)間3 h的條件下，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原花青素提取率有先上升后下降的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50 %時(shí)，原花青素提取率最大。繼續(xù)增大乙醇的體積分?jǐn)?shù)，原花青素提取率開(kāi)始下降。綜合考慮，選擇50 %、60 %、70 %作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.2提取溫度對(duì)提取率的影響

在提取溶劑為50 %乙醇，料液比為1∶10（g/mL），提取時(shí)間為3 h條件下，不同提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction yield of proanthocyanidins

由圖2可知，隨提取溫度的升高，蓮子殼原花青素提取率先上升后下降，當(dāng)提取溫度小于65℃時(shí)，原花青素提取率隨溫度的上升而提高，溫度高于65℃后，原花青素提取率隨溫度的上升而降低，這是由于溫度高于65℃時(shí)，原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞。綜合考慮，選擇55、65、75℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.3料液比對(duì)提取率的影響

在提取溶劑為50 %乙醇，提取溫度為65℃，提取時(shí)間為3 h條件下，不同料液比對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on the extraction yield of proanthocyanidins

由圖3可知，隨著溶劑倍數(shù)的增大，蓮子殼原花青素提取率逐漸增大，料液比增加到1∶10（g/mL）時(shí)，原花青素提取率的變化趨勢(shì)逐漸變緩。綜合考慮，選擇1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在提取溶劑為50 %乙醇，料液比為1∶10（g/mL），提取溫度為65℃條件下，不同提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of time on the extraction yield of proanthocyanidins

由圖4可知，提取時(shí)間小于2 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蓮子殼原花青素提取率逐漸增大，提取時(shí)間延長(zhǎng)至2 h時(shí)，原花青素提取率的變化趨勢(shì)逐漸變緩。綜合考慮，選擇1、2、3 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)，因素與水平、結(jié)果與分析分別如表1、表2。

由正交試驗(yàn)結(jié)果看出，對(duì)蓮子殼中原花青素提取率的影響因素的主次順序?yàn)椋禾崛囟龋–）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>料液比（B）>提取時(shí)間（D），提取工藝的最佳組合為：C2A1B3D3，即最佳提取條件為：提取溫度65℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50 %，料液比1∶10（g/mL），提取時(shí)間3 h。進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，原花青素的提取率分別為89.63 %、89.36 %、90.18 %，平均值為89.72 %，RSD為0.47 %。與正交試驗(yàn)2號(hào)所得提取率91.91 %相比，由最佳提取條件所得的提取率偏低，原因可能是正交試驗(yàn)過(guò)程中存在偶然誤差，使得2號(hào)測(cè)定結(jié)果偏高，綜合分析，可以將C2A1B3D3確定為最佳提取工藝。

表1正交試驗(yàn)L9（34）因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.3蓮子殼原花青素含量測(cè)定

按照上述所得蓮子殼原花青素最佳提取工藝，稱取蓮子殼藥材適量，粉碎，加入8倍藥材量的50 %的乙醇溶液，65℃回流浸漬提取兩次，每次3 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，繼續(xù)濃縮至浸膏狀，真空干燥后，采用上述色譜條件測(cè)定5批蓮子殼提取物中原花青素的含量。測(cè)得原花青素的含量分別為38.62、38.65、38.88、37.95、38.39 g/100 g，平均含量為38.50 g/100 g，RSD為0.91 %。

3　結(jié)論

本研究采用回流浸漬法進(jìn)行蓮子殼原花青素的提取，以原花青素的提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)方法，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比及提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響。最終確定蓮子殼中原花青素的最佳提取工藝如下：提取溶劑為50 %乙醇，提取溫度65℃，料液比1∶10（g/mL），提取時(shí)間3 h，回流浸漬提取2次。將所得提取液減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥后，可得蓮子殼提取物。優(yōu)選的最佳提取方法操作簡(jiǎn)單，提取物中有效成分含量穩(wěn)定，適合于工業(yè)生產(chǎn)，為蓮子殼的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考價(jià)值。

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Study on the Extraction Technology of Proanthocyanidins from Lotus Seed Shell by Orthogonal Test

TONG Xi-di，PENG Hong*
（Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，Jiangxi，China）

Abstract：The extraction process for proanthocyanidins in Lotus seed shell were optimized in this paper. With the content of proanthocyanidins as indexes，the single factor and orthogonal test was adopted to research the effects of 4 facters，including the concentration and volume of alcohol，solid-liquid ratio，the temperature and extraction time on the extraction yield of proanthocyanidins from Lotus seed shell. The results showed that the best extraction conditions were：extraction agent 50 % of alcohol，solid-liquid ratio 1∶10（g/mL），temperature 65℃and extraction time 3 h. The extraction process was simple and reasonable，suitable for industrial production.

Key words：Lotus seed shell；proanthocyanidins；extraction technology；orthogonal test

收稿日期：2014-07-25

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.016

*通信作者：彭紅（1964—），女（漢），教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事藥物質(zhì)量控制研究。

作者簡(jiǎn)介：童錫迪（1988—），女（漢），在讀碩士研究生，從事藥物質(zhì)量控制研究。