冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷血腦屏障通透性的影響

徐露，張?zhí)?重慶醫(yī)科大學(xué)生化與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 40006；.重慶市中醫(yī)院，重慶 4000

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冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷血腦屏障通透性的影響

徐露1，張?zhí)?
1.重慶醫(yī)科大學(xué)生化與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021

摘要：目的觀察冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)缺氧/復(fù)氧下血腦屏障（BBB）通透性的影響，探討其保護(hù)BBB的作用機(jī)制。方法培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC），在缺氧培養(yǎng)箱中缺氧2 h，再?gòu)?fù)氧24 h，建立單層BMEC體外BBB模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、冰片組、燈盞花素組、冰片＋燈盞花素組，各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，檢測(cè)各組跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（TEER）值和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的通透性，ELISA、Western blot檢測(cè)BMEC中緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)。結(jié)果缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致TEER值降低，HRP通透率增加，ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)降低；冰片聯(lián)合燈盞花素可明顯改善上述損傷。結(jié)論冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)缺氧/復(fù)氧下BBB的損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)ZO-1、Claudin-5蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：冰片；燈盞花素；血腦屏障；大鼠

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是人體的一道重要生理屏障，主要作用是阻止某些有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，同時(shí)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦組織，BBB在保持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起積極的作用。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）是BBB的重要組成部分，其特殊的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和細(xì)胞間緊密連接，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)外物質(zhì)交換中起重要的作用。然而當(dāng)腦組織受到炎癥侵襲、缺血、缺氧損傷時(shí)，BMEC及其緊密連接的完整性遭到破壞，使BBB通透性增高，大量有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織后加重腦神經(jīng)血管損傷。

燈盞花素是臨床常用的腦保護(hù)劑，能改善腦微循環(huán)、減輕腦組織損傷[1]。但燈盞花素水溶性較高，難以通過(guò)BBB，如能在腦組織中提高其藥物濃度，療效會(huì)更為明顯。冰片是一種芳香開竅藥物，有研究表明，冰片能抑制P-糖蛋白，協(xié)助其他難通過(guò)BBB的藥物進(jìn)入BBB[2]。本實(shí)驗(yàn)將冰片和燈盞花素聯(lián)合用藥，觀察其對(duì)缺氧/復(fù)氧下BBB通透性的影響，探討其保護(hù)BBB的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)7日齡SD大鼠6只，體質(zhì)量（30±5）g，雌雄不限，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)XCXK（渝）20090006，封閉且無(wú)菌條件下飼養(yǎng)。

1.2藥物

燈盞花素（20 mg/支），湖南恒生制藥有限公司，純度≥95%，批號(hào)20131012，用生理鹽水配制成1 mg/mL溶液備用；天然冰片，河南萬(wàn)博化工產(chǎn)品有限公司，純度95%，批號(hào)A130916，用0.8%羧甲基纖維素鈉配制成0.5 mg/mL混懸液備用。

1.3主要試劑與儀器

辣根過(guò)氧化物酶（HRP），Sigma公司；ELISA試劑盒、Western blot試劑盒、組織蛋白提取試劑、兔抗ZO-1單克隆抗體和小鼠抗Claudin-5單克隆抗體，Santa Cruz公司。Bio-Red酶標(biāo)儀（美國(guó)Gene公司），跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（TEER）儀（美國(guó)Millipore公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Thermo公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[3]，將SD大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡3～5 min進(jìn)行消毒?？焖偃〕鋈X，置于預(yù)冷的D-Hank's液中，去除小腦、間腦、血管、腦膜等，保留皮質(zhì)。用眼科剪將腦組織剪成約1 mm3碎片，再加0.7 mg/mLⅡ型膠原酶，37 ℃消化1 h，1000×g離心10 min，棄上清液，加20%BSA，1000×g離心20 min，保留底層沉淀。再加1 mg/mL膠原酶/分散酶，37 ℃消化1 h，700×g離心6 min，棄上清液，DMEM液漂洗2次，棄上清液，加DMEM培養(yǎng)液（20%胎牛血清FBS、2 mmol/L L-谷氨酸、30 μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100 μg/mL肝素鈉）后，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，2 d后換液，單層BMEC長(zhǎng)成后融合70%～80%時(shí)傳代。用消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA組成）消化，消化終止后用巴氏管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1000×g離心5 min，棄上清液，加DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)板中。

2.2分組、造模及給藥

將培養(yǎng)的BMEC密度調(diào)至4×105/mL，吸取0.5 mL接種于Transwell板上，多聚酯細(xì)胞膜的細(xì)胞密度約為2×105/cm2，向Transwell板加1.5 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞融合時(shí)分為5組：正常對(duì)照組Transwell板全程正常孵育；模型組置于缺氧培養(yǎng)箱中2 h，再迅速置于正常培養(yǎng)箱中24 h；冰片組根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[4]，置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加冰片使其終濃度為5 μmol/L；燈盞花素組根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加燈盞花素使其終濃度為10 μmol/L；冰片＋燈盞花素組置于正常培養(yǎng)箱時(shí)加冰片和燈盞花素使其終濃度分別為5 μmol/L和10 μmol/L。

2.3跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值測(cè)定

待BMEC達(dá)到融合狀態(tài)后，將電阻儀電極插入Transwell小室中，計(jì)算TEER值[（測(cè)得電阻值－基礎(chǔ)電阻值）÷小室膜面積]，測(cè)量每組復(fù)氧24 h時(shí)TEER值。

2.4辣根過(guò)氧化物酶通透率測(cè)定

棄Transell板內(nèi)培養(yǎng)基，在供體池中加含有500 ng HRP培養(yǎng)基，在受體池中加1150 μL相同培養(yǎng)基，使Transwell內(nèi)外液面相平，于復(fù)氧后24 h從受體池中取樣50 μL，向樣品中各加50 μL四甲基聯(lián)苯胺溶液和H2O2，顯色10 min，加1 mol/L H2SO450 μL終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度（A）值。另將10 ng/mL HRP溶液用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基等比稀釋，按上述方法顯色并測(cè)定A值，計(jì)算HRP通透率[（CHRP受體池×V受體池）÷（CHRP供體池×V供體池）× 100%][5]。

2.5ELISA檢測(cè)ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)

嚴(yán)格按照Z(yǔ)O-1及Claudin-5 ELISA試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各組A值。

2.6Western blot檢測(cè)ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)

棄Transell板內(nèi)培養(yǎng)基，用預(yù)冷濃度為0.01 mol/L 的PBS沖洗3次，加冰的裂解液，0 ℃放置30 min，再將細(xì)胞刮掉，離心后棄上清液，得到總蛋白。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)情況，所得條帶用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4　結(jié)果

4.1冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)大鼠跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值和辣根過(guò)氧化物酶通透率的影響

缺氧/復(fù)氧損傷可顯著降低BBB的TEER值，增加HRP通透率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，冰片組TEER值和HRP通透率均無(wú)明顯差異（P＞0.05），燈盞花素組和冰片＋燈盞花素組TEER值明顯升高，HRP通透率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以冰片＋燈盞花素組效果更為顯著。結(jié)果見表1。

表1　各組內(nèi)皮細(xì)胞TEER值和HRP通透率比較（±s）

表1　各組內(nèi)皮細(xì)胞TEER值和HRP通透率比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01（下同）

組別　n TEER值/（?/cm2）　HRP通透率/%正常對(duì)照組　10　40.05±3.16　0.61±0.08模型組　10　17.26±2.02**　2.09±0.21**冰片組　10　18.78±3.00**　1.89±0.21**燈盞花素組　10　31.59±4.27**##　1.34±0.23**##冰片＋燈盞花素組　10　35.74±5.34*##　1.14±0.16**##

4.2冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，缺氧/復(fù)氧損傷后ZO-1及Claudin-5蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；冰片組、燈盞花素組、冰片＋燈盞花素組均能顯著上調(diào)ZO-1 及Claudin-5蛋白表達(dá)（P＜0.01），冰片＋燈盞花素組作用更為顯著。結(jié)果見表2、表3、圖1。

表2　ELISA檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和Claudin-5蛋白表達(dá)比較（±s，A值）

表2　ELISA檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和Claudin-5蛋白表達(dá)比較（±s，A值）

組別　n　　ZO-1　　Claudin-5正常對(duì)照組　10　0.41±0.02　0.35±0.03模型組　10　0.12±0.02**　0.10±0.04**冰片組　10　0.28±0.03**##　0.18±0.05**##燈盞花素組　10　0.30±0.04**##　0.25±0.03**##冰片＋燈盞花素組　10　0.36±0.02**##　0.33±0.03**##

表3　Western blot檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和Claudin-5蛋白表達(dá)比較（±s）

表3　Western blot檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1和Claudin-5蛋白表達(dá)比較（±s）

組別　n　　ZO-1　　Claudin-5正常對(duì)照組　10　1.21±0.11　0.96±0.14模型組　10　0.22±0.10**　0.30±0.07**冰片組　10　0.37±0.07**##　0.39±0.09**燈盞花素組　10　0.61±0.08**##　0.46±0.07**##冰片＋燈盞花素組　10　0.85±0.09**##　0.76±0.08**##

圖1　各組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1及Claudin-5蛋白免疫印跡圖

5　討論

BMEC作為BBB形成的主要結(jié)構(gòu)，它們之間形成的緊密連接是BBB主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)緊密連接蛋白的表達(dá)量、位置分布或結(jié)構(gòu)功能等發(fā)生改變時(shí)，BMEC及其緊密連接的完整性遭到破壞，從而使BBB通透性增高，大量有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織后加重腦神經(jīng)血管損傷。作為與緊密連接密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白ZO-1 和Claudin-5蛋白更起著非常重要的作用。有研究表明，ZO-1缺失將會(huì)導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞[6]；Claudin-5表達(dá)下降也已被證明與血管通透性增加密切相關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)使用冰片，其TEER值和HRP通透率與模型組比較并無(wú)顯著差異，單用燈盞花素和冰片聯(lián)合燈盞花素均可明顯增加TEER值和降低HRP通透率，維持BBB的完整性，但冰片聯(lián)合燈盞花素效果更為明顯。ELISA和Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，燈盞花素和冰片聯(lián)合燈盞花素均可明顯促進(jìn)ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)。

綜上所述，冰片聯(lián)合燈盞花素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷BBB具有明顯的保護(hù)作用，且與單用燈盞花素比較，聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)藥理效應(yīng)，根據(jù)Western blot、ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙重提示，其作用機(jī)制可能為上調(diào)ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)，維持BMEC及其緊密連接的完整性。

[1] 唐省三,馬亞珍.燈盞花素注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注局灶性腦損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床康復(fù),2005,9(29)：243-245.

[2] 朱國(guó)棟.冰片開放血腦屏障及通過(guò)P糖蛋白介導(dǎo)的機(jī)制研究[D].廣州：廣州醫(yī)學(xué)院,2009.

[3] 郭虹,康立源,柴麗娟,等.燈盞細(xì)辛總咖啡酸酯對(duì)TNF-α誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2009,36(9)：1554-1556．

[4] 胡利民.冰片及配伍對(duì)血腦屏障通透性的影響和腦保護(hù)作用機(jī)制研究[D].天津：天津中醫(yī)學(xué)院,2004.

[5] 李江輝,潘長(zhǎng)旺,胡昕,等.血腦屏障細(xì)胞模型的構(gòu)建[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2008,12(3)：894-896.

[6] YU H, WANG P, AN P, et al. Recombinant human angiopoietin-1 ameliorates the expressions of ZO-1, occludin, VE-cadherin, and PKCa signaling after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats[J]. J Mol Neurosci,2012,46(1)：236-247.

[7] KIM J, CHAE Y K. Geomewide association studies of stroke[J].N Engl Med,2009,361(7)：722-723.

（修回日期：2015-06-10；編輯：華強(qiáng)）

·中藥研究與開發(fā)·

Effects of Borneolum Syntheticum Combined with Breviscapine on Blood-brain BarrierPermeability Induced by Hypoxia/Reoxygenation Injury

XU Lu1, ZHANG Tai-jun2(1. Key Lab of Biochemical and Molecular Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400021, China)

Abstract:Objective To observe effects of Borneolum Syntheticum combined with breviscapine on blood-brain barrier (BBB) permeability induced by hypoxia/reoxygenation injury. Methods The BBB model in vitro was established by primarily culturing brain microvascular endothelial cells (BMEC), hypoxia 2 h and reoxygenation 24 h. The experiment was divided into normal control group, model group, Borneolum Syntheticum group, breviscapine group, and Borneolum Syntheticum-breviscapine group. All treatment groups were given relevant medicine. TEER and HRP were detected; ELISA and Ｗestern blot was used to detect the expressions of ZO-1 and Claudin-5 in BMEC. Results Hypoxia/reoxygenation induced injury decreased TEER, increased permeability rate of HRP, and decreased the expressions of ZO-1 and Claudin-5; while Borneolum Syntheticum combined with breviscapine could improve damage caused by hypoxia/reoxygenation. Conclusion Borneolum Syntheticum combined with breviscapine shows obvious protective effect on BBB permeability induced by hypoxia/reoxygenation, and the mechanism is involved in the regulation of ZO-1 and Claudin-5 protein expressions.

Key words:Borneolum Syntheticum; breviscapine; blood-brain barrier; rats

收稿日期：（2015-05-14）

通訊作者：張?zhí)?，E-mail：4345422@qq.com

基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金（cstc2012jjA10137）

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0076-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.021