響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹黃酮超聲輔助提取工藝及對(duì)酪氨酸酶活性抑制研究

王英豪，陳志春，張理平，陳桂芬，宋澤杰.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350；.福州屏山制藥廠，福建 福州 35000

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響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹黃酮超聲輔助提取工藝及對(duì)酪氨酸酶活性抑制研究

王英豪1，陳志春2，張理平1，陳桂芬1，宋澤杰1
1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福州屏山制藥廠，福建 福州 350001

摘要：目的優(yōu)選桑椹黃酮的提取工藝及其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制。方法在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度為自變量，黃酮含量為響應(yīng)值，建立二次回歸方程，研究各因素對(duì)黃酮含量的影響，同時(shí)運(yùn)用多巴速率氧化法測(cè)定提取液對(duì)酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果通過(guò)二次回歸模型響應(yīng)面分析確定了超聲輔助提取桑椹黃酮的最佳條件：40%乙醇，料液比1∶30，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間50 min。在此條件下，黃酮含量為（19.16±0.23）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值吻合，酪氨酸酶抑制率為（61.47±1.79）%。結(jié)論由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的桑椹黃酮提取工藝方便可行，且具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制作用。

關(guān)鍵詞：桑椹；黃酮；響應(yīng)面分析法；超聲提取法；酪氨酸酶

酪氨酸酶是催化人體色素生成的限速酶，若人體的酪氨酸酶活性增強(qiáng)則會(huì)引起色素大量生成、沉淀，導(dǎo)致黃褐斑、老年斑等皮膚色素沉淀性疾病[1]。皮膚色素沉淀性疾病是皮膚科疑難病證，西醫(yī)采用維甲酸、曲酸等藥物治療，但存在一定不良反應(yīng)[2]。尋找有效抑制黑素生成的天然脫色劑是目前研究的熱點(diǎn)。近十幾年來(lái)，從植物藥中找尋天然酪氨酸酶抑制劑引起廣泛關(guān)注，如白術(shù)、茯苓等[3-4]。桑椹為?？浦参锷orus alba L.的干燥果穗，味甘酸，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥功效。桑椹資源豐富，藥食兩用，含有豐富的黃酮類物質(zhì)及多種糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)元素，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降糖、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用[5-9]。目前響應(yīng)面法已被廣泛用于同時(shí)存在多因素影響的試驗(yàn)優(yōu)化[10-11]，其具有試驗(yàn)組合少、求得回歸方程精準(zhǔn)度高，且可同時(shí)研究幾種因素交互作用等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹總黃酮的超聲輔助提取工藝，并對(duì)其抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行初步研究，以期為桑椹的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　儀器、試藥與溶液配制

高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津公司），十萬(wàn)分之一電子天平（DV215CD，美國(guó)奧豪斯公司），紫外-可見分光光度計(jì)（UV-9100，北京瑞利分析儀器公司），超聲微波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52，上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，國(guó)華電器有限公司），低速離心機(jī)（TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-200707），槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-200907），L-多巴（西安潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司，批號(hào)060108），蘑菇酪氨酸酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)CAS9002-10-2）。碳酸氫鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇等均為分析純。桑椹藥材購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門診部（產(chǎn)地福建省尤溪縣，批號(hào)20120915），經(jīng)王河山老師鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥果穗。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8）：氫氧化鈉1.9 g，磷酸二氫鈉15.6 g溶于1 L雙蒸水中。酪氨酸酶：臨用前以PBS稀釋為1000 U/mL的溶液。L-多巴：以PBS稀釋為1.0 g/L的溶液。對(duì)照品溶液：分別精密稱取蘆丁對(duì)照品5.2 mg、槲皮素2.5 mg，分別置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.208 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液和0.208 mg/mL槲皮素對(duì)照品溶液。

2　方法與結(jié)果

2.1黃酮含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]方法。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以70%乙醇作為參比溶液，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值（Y）和含量（X）進(jìn)行回歸，求得線性回歸方程Y＝11.671X－0.003（r2＝0.999 9），表明黃酮含量在0.104～1.664 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 參[12]方法。采用用蘑菇酪氨酸酸酶多巴速率率氧化法檢測(cè)，吸取取L-多巴溶液液（1.0 mg/mmL）1.5 mL，加PBS（pH＝6.88）1.0 mL，225 ℃溫浴100 min，然后后加提取液（75 mgg/mL）0.5 mLL，同時(shí)加蘑蘑菇酪氨酸酶酶（1000 U/mL）0..04 mL，在4475 nm處測(cè)定樣品的吸吸光度（加入蘑菇酪酪氨酸酶后立立刻計(jì)時(shí)，記錄5 min內(nèi)每分鐘末的吸光度度值）。取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行行測(cè)定3次。用曲酸酸（0.1 mg/mmL）代替提取物作為陽(yáng)性組，，同法測(cè)定吸吸光度，取平平均值，計(jì)算算酪氨酸酶抑抑制率。。酪氨酸酶活活性抑制率（%）＝[（AA1－A2）－（A3－A4）]÷（（A1－A2）××l00%。式中中，A1為未未加提取取液的加酶混混合液，A2為未加提取取液和酶的混混合液，，A3為加提提取液和酶的混混合液，A4為加提取液液而未加加酶的混合液液。

2.2提取工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g 共5份，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇60 mL，60 ℃超聲提取30 min，提取液濃縮定容至10 mL。精密移取濃縮液0.25 mL至25 mL容量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見圖1?？梢?，隨著乙醇濃度的增加，提取液中黃酮含量增加，在乙醇濃度為50%時(shí)達(dá)到峰值，此后出現(xiàn)較大幅度下降。此外，隨著乙醇濃度的增加，脂溶性提取物亦增加，會(huì)給后續(xù)純化帶來(lái)麻煩。綜合考慮，乙醇濃度以50%為宜。

圖1　乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響

2.2.2料液比精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g共5份，分別加入50%乙醇30、45、60、75、90 mL，60 ℃下提取30 min。提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見圖2。可見，隨著料液比的增加，黃酮含量呈上升趨勢(shì)，且在1∶25時(shí)達(dá)到峰值，此后出現(xiàn)小幅度下降。雖然增加料液比能在一定程度上增加黃酮的提取量，但會(huì)增加生產(chǎn)成本且不利于后期濃縮工藝。綜合考慮，料液比以1∶25為宜。

圖2　料液比對(duì)黃酮含量的影響

2.2.3超聲溫度精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g 共5份，分別加入50%乙醇75 mL，分別在40、50、60、70、80 ℃提取30 min，提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見圖3。可見，隨著溫度的升高，黃酮的含量亦增加，但是高溫可能會(huì)導(dǎo)致一些活性成分失活，而且會(huì)增加雜質(zhì)的溶解度，同時(shí)隨著溫度升高，乙醇揮發(fā)更快，導(dǎo)致體積分?jǐn)?shù)下降。綜合考慮，超聲溫度以80 ℃為宜。

圖3　超聲溫度對(duì)黃酮含量的影響

2.2.4超聲時(shí)間精密稱定干燥的桑椹粉末約3.0 g 共5份，分別加入50%乙醇75 mL，在80 ℃分別提取10、20、30、40、50 min，提取液濃縮定容至10 mL。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)3次，結(jié)果見圖4?？梢?，在10～30 min內(nèi)，黃酮含量迅速上升，但超過(guò)30 min后黃酮含量?jī)H小幅提升，故超聲時(shí)間以30 min為宜。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響

2.3最佳工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)利用響應(yīng)面法中Box-Behnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定4個(gè)因素（自變量）的3個(gè)水平，以黃酮含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)桑椹黃酮的最佳工藝參數(shù)。因素水平及編碼見表1，結(jié)果見表2。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼

通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得黃酮含量（Y）對(duì)乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、超聲時(shí)間（X3）、超聲溫度（X4）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y＝13.83－0.81X1＋0.27X2＋0.40X3＋0.43X4－0.81X1X2＋0.21X1X3＋0.44X1X4－0.14X2X3＋0.65X2X4－0.16X3X4－0.022X12＋0.33X22＋1.69X32＋1.33X42。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向[13]。由此可知，影響桑椹黃酮含量的因素主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋境暅囟龋境晻r(shí)間＞料液比。

2.3.2方差分析為了檢驗(yàn)得到的多元二次回歸模型的有效性，對(duì)該模型和模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，一次項(xiàng)乙醇濃度（X1）偏回歸系數(shù)較為顯著，二次項(xiàng)X32、X42偏回歸系數(shù)極顯著，其余變量的系數(shù)影響均不顯著，表明乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)桑椹黃酮含量影響較大。整體分析可知，模型P＝0.027，表明選用的模型較為顯著；而失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型的擬合程度良好；決定系數(shù)R2＝0.958 6，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性，響應(yīng)值的變化有95.86%與所選變量相關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果具有較好的可靠性，可用該模型對(duì)桑椹黃酮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，見表3。

表3　回歸模型方差分析

2.3.3響應(yīng)面分析與優(yōu)化通過(guò)對(duì)各因素的響應(yīng)面圖和等高線圖的分析，可以直觀地判斷各因素之間的交互作用程度及各單因素的變化趨勢(shì)。根據(jù)回歸分析結(jié)果所得響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。

圖5　兩因素交互作用對(duì)黃酮含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

當(dāng)當(dāng)超聲溫度和和超聲時(shí)間為為0水平時(shí)，隨著乙醇濃濃度的增增加，黃酮含含量呈下降趨趨勢(shì)，黃酮含量最大值出現(xiàn)在低乙醇濃度（40%）與高高料液比（1∶30）的交交匯處。當(dāng)料液比和和超聲時(shí)間為為0水平時(shí)，黃酮含量隨隨著乙醇濃度的增加加而下降，在在超聲溫度達(dá)到70 ℃前，黃酮含量小幅上升升，當(dāng)溫度超超過(guò)70 ℃后，黃酮含量量顯著增加。同時(shí)，黃酮含量隨隨著超聲時(shí)間的增加顯著著增加，最大值出現(xiàn)現(xiàn)在低乙醇濃濃度（40%）與長(zhǎng)超聲時(shí)時(shí)間（50 min）交匯匯處。

通通過(guò)Design--Expert 8.0.55軟件優(yōu)化分分析，獲得了模型預(yù)預(yù)測(cè)的最佳條條件及黃酮含含量理論預(yù)測(cè)測(cè)值，見表4?？紤]到到實(shí)際操作的的可行性，確確定最佳條件件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)數(shù)40%、料液液比1∶30、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間50 min。在此此條件下進(jìn)行行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次測(cè)得黃酮酮含量分別為為19.23、19..36、18.91 mg/g，平均值19.16mg/g，與模模型預(yù)測(cè)值誤差僅為3.1%，且與課題組前期試驗(yàn)測(cè)定定的傳統(tǒng)提取工藝中桑椹黃酮含量[（11.87±1.06）mg/g，n＝＝3）]相比，含量顯著提高（PP＜0.01）。因因此，基于響響應(yīng)曲面法所所得的優(yōu)化工藝參數(shù)數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的的實(shí)用價(jià)值。

表4　模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值

2.4酪氨酸酶活活性抑制研究究

桑桑椹提取液和和曲酸陽(yáng)性藥藥對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用用見圖6?？煽芍?，桑椹提提取液和曲酸對(duì)酪氨酸酶活性的抑制均在第2分鐘達(dá)峰值，最佳工藝條件桑椹提取液[黃酮含量（19.16±0.23）mg/g]的酪氨酸酶活性抑制率為（61.47±1.79）%，與陽(yáng)性藥曲酸的抑制率[（59.70±2.02）%]相當(dāng)，顯著高于傳統(tǒng)工藝桑椹提取液[黃酮含量（11.87±1.0 6）mg/g]的抑制率[（29.62±3.53）%]。提示桑椹對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，活性成分可能為黃酮類物質(zhì)。隨著黃酮含量的增加，抑制率亦顯著增加。

圖6　曲酸和桑椹提取液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

3　討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)桑椹黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶30、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間50 min。在此條件下，桑椹黃酮含量為（19.16± 0.23）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值19.77 mg/g誤差僅為3.1%，表明所得模型擬合程度高，準(zhǔn)確可靠，可用于桑椹黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化篩選。

最佳工藝的桑椹提取液不僅黃酮含量顯著提高，且體外酪氨酸酶活性抑制作用亦顯著增加，其活性成分可能為黃酮類物質(zhì)。提示桑椹所含黃酮類物質(zhì)可進(jìn)一步開發(fā)為天然的酪氨酸酶抑制劑，用于治療皮膚色素沉淀性疾病或制備美白保健品。

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（修回日期：2015-05-17；編輯：陳靜）

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Mori Fructusby Response Surface Methodology and Study on Anti-tyrosinase Activity

WANG Ying-hao1, CHEN Zhi-chun2, ZHANG Li-ping1, CHEN Gui-fen1, SONG Ze-jie1(1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Pingshan Pharmaceutical Factory of Fuzhou, Fuzhou 350001, China)

Abstract:Objective To optimize the extraction technology of flavonoids from Mori Fructus and study its anti-tyrosinase activity. Methods Response surface methodology Box-Behnken center combination was adopted to design the experiment based on the results of the single-factor experiments. Ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic temperature and time were set as independent variables and flavonoid content was set as response value to establish a quadratic regression model. In addition, the effects of the extract on tyrosinase were investigated by using the rate of dopamine oxidation method. Results The optimum ultrasonic-assisted extraction technology was confirmed by response surface of quadratic regression model: ethanol concentration of 40%, solid-liquid ratio of 1:30, ultrasonic temperature of 60 ℃, and ultrasonic time of 50 min. Under these conditions, the actual contents of total flavonoids were (19.16±0.23)mg/g, which were in accordance with the theoretically predicted values. And its inhibition rate of tyrosinase activity was (61.47±1.79)%. Conclusion The extraction technology of flavonoids from Mori Fructus by response surface methodology is convenient and feasible, and has good effect of anti-tyrosinase activity.

Key words:Mori Fructus; flavonoids; response surface methodology; ultrasonic-assisted extraction technology; tyrosinase

收稿日期：（2015-04-26）

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（2013J01377）

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-5304(2016)02-0093-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.026