抗衰片對(duì)電離輻射損傷后小鼠骨髓造血作用的影響

康肖夢(mèng)，王華偉，杜利清，趙潔，張宇睿，王華南，楊福軍，徐文清

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抗衰片對(duì)電離輻射損傷后小鼠骨髓造血作用的影響

康肖夢(mèng)，王華偉，杜利清，趙潔，張宇睿，王華南，楊福軍Δ，徐文清Δ

摘要：目的探討抗衰片對(duì)電離輻射損傷后小鼠造血重建的調(diào)控影響。方法9～10周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為照射對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。后3個(gè)劑量組分別按0.75、1.5、3.0 g/kg體質(zhì)量灌服抗衰片水溶液，照射對(duì)照組給予同體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥11 d。第4天對(duì)4組小鼠進(jìn)行6.0 Gy137Cs-γ射線單次全身照射。照射后第8天，觀察小鼠內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)（即脾集落形成單位，CFU-S）、小鼠骨髓粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）和骨髓成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）的生成情況。同時(shí)，體外擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）與正常供體小鼠的造血干細(xì)胞（HSC）進(jìn)行二維共培養(yǎng)（2D CFU-GM），通過2D CFU-GM檢測(cè)輻射損傷后藥物作用的MSC促進(jìn)HSC的增殖能力。結(jié)果與照射對(duì)照組相比，3個(gè)劑量組的CFU-GM數(shù)目顯著增多，中劑量組及高劑量組CFU-S、CFU-F、2D CFU-GM增殖能力顯著提高（均P＜0.05）。結(jié)論抗衰片可以促進(jìn)電離輻射損傷后小鼠造血系統(tǒng)重建。

關(guān)鍵詞：抗衰片；輻射損傷；造血重建；間質(zhì)干細(xì)胞；造血干細(xì)胞

電離輻射可對(duì)機(jī)體造成一系列嚴(yán)重?fù)p傷，包括免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等，其中以骨髓造血系統(tǒng)最為敏感[1]。輻射損傷后造血系統(tǒng)功能恢復(fù)在輻射損傷的救治中處于核心地位。因此，尋找調(diào)控造血恢復(fù)的有效手段以提高輻射損傷的救治效果，對(duì)輻射損傷或意外照射患者的救治十分重要。

中醫(yī)認(rèn)為，射線是“火熱毒邪”，作用人體會(huì)導(dǎo)致熱毒過盛、津液受損，進(jìn)而灼津爍血、傷陰耗氣，導(dǎo)致氣血損傷、脾胃失調(diào)、肝腎虧損等。因此，應(yīng)該以清熱解毒、養(yǎng)陰生津、健脾和胃、滋補(bǔ)肝腎等作為輻射損傷的治療原則。中藥復(fù)方抗衰片具有健脾益腎、滌痰降濁、活血散結(jié)的功效。此方中丹參活血通絡(luò)；桑寄生、淫羊藿、何首烏、杜仲調(diào)補(bǔ)肝腎、益精填髓；茯苓、菖蒲祛痰開竅；龜甲益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心；黨參補(bǔ)中益氣、健脾益肺[2-3]。全方可調(diào)和陰陽，扶正祛邪，填精補(bǔ)髓，強(qiáng)身健腦。因此，本研究以抗衰片作為藥物干預(yù)手段，探討輻射損傷后通過改善造血微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控造血重建作用，為臨床輻射損傷的救治尤其是放療后造血系統(tǒng)損傷的恢復(fù)提供借鑒作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)9～10周齡雄性C57BL/6小鼠40只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度55%±5%，壓力差≤10 Pa，每日光照12h，自由攝食飲水。主要材料：生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液；中國大冢制藥有限公司）；MesenCult?MSC Basalmedium（Mouse；STEMCELL TECHNOLOGIES公司，產(chǎn)品號(hào)：05501）；MesenCult?MSC Stimulatory Supplements（Mouse；STEMCELL公司，產(chǎn)品號(hào)：05502）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；IMDM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，HyClone公司）；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；胰蛋白酶（Invitrogen公司）。主要儀器：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2FD）；CO2培養(yǎng)箱（NAP? COmODEL 5410）；倒置顯微鏡（OLYMPUS IM）；137Cs-γ射線照射源（加拿大原子能有限公司，Gammacel 40）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥將40只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為照射對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。3個(gè)給藥組分別按0.75、1.5、3.0 g/kg灌服抗衰片水溶液，照射對(duì)照組給予同體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃11 d。第4天對(duì)4組小鼠進(jìn)行6.0 Gy137Cs-γ射線單次全身照射，劑量率1 Gy/min。照后繼續(xù)給藥7 d。

1.2.2脾結(jié)節(jié)（即脾集落形成單位，CFU-S）計(jì)數(shù)照后第8天，處死小鼠。取脾臟，Bouin氏液固定，計(jì)數(shù)其表面突起的CFU-S。

1.2.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）獲得與培養(yǎng)無菌條件下，取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，剔除表面肌肉和結(jié)締組織，用含2% FBS的IMDM沖出骨髓，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，400×g離心1min，MSC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于25 cm2培養(yǎng)瓶中37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4骨髓粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）計(jì)數(shù)調(diào)整骨髓細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，將細(xì)胞液加入到甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，渦旋混勻后接種至12孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，第8～12天觀察、計(jì)數(shù)。

1.2.5骨髓成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）計(jì)數(shù)用MSC培養(yǎng)基調(diào)整骨髓細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，接種至6孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔，第7～8天觀察。

1.2.6MSC支持HSC增殖的二維共培養(yǎng)研究（2D CFUGM）取第2代MSC，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×105個(gè)/mL，接種至6孔板。24h細(xì)胞貼壁后，吸去MSC培養(yǎng)基，每孔加入1× 105個(gè)/mL正常C57BL/6供體小鼠骨髓細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔，第10天左右觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CFU-S檢測(cè)結(jié)果與照射對(duì)照組和低劑量組相比，中、高劑量組的脾結(jié)節(jié)數(shù)目均顯著升高（P＜0.05）。說明抗衰片對(duì)受照小鼠髓外造血功能有促進(jìn)作用，見圖1。

Fig.1　Effects of KS tablet on CFU-S ofmice treated with137Cs-γ ray圖1　抗衰片對(duì)137Cs-γ射線損傷小鼠脾結(jié)節(jié)的影響

2.2CFU-GM檢測(cè)結(jié)果與照射對(duì)照組相比，3個(gè)劑量組的CFU-GM增殖能力顯著提高，且高劑量組的CFU-GM增殖能力顯著高于低劑量組（P＜0.05）。說明抗衰片對(duì)受照小鼠HSC增殖能力的提高有促進(jìn)作用，見圖2。

Fig.2　Effects of KS tablet on CFU-GM in four groups圖2　抗衰片對(duì)各組CFU-GM的影響

2.3CFU-F檢測(cè)結(jié)果與照射對(duì)照組相比，中、高劑量組的CFU-F增殖能力均有顯著提高，且中劑量組高于低、高劑量組（P＜0.05）。說明抗衰片對(duì)受照小鼠MSC具有促進(jìn)作用，見圖3。

Fig.3　Influence of KS tablet on CFU-F ofmSC in four groups圖3　抗衰片對(duì)各組間充質(zhì)干細(xì)胞CFU-F的影響

2.4MSC與HSC共培養(yǎng)2D CFU-GM的結(jié)果與照射對(duì)照組相比，中、高劑量組的2D CFU-GM增殖能力提高（P＜0.05）。3個(gè)劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

Fig.4　Influence of KS tablet onhSC functions supported bymSC （2D CFU-GM）圖4　抗衰片對(duì)MSC支持HSC功能（2D CFU-GM）的影響

3　討論

電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p傷，其中尤以骨髓造血系統(tǒng)最為敏感。射線對(duì)HSC產(chǎn)生殺傷同時(shí)，也對(duì)骨髓造血微環(huán)境造成損傷[4]。目前的研究多側(cè)重于HSC的調(diào)控方面，而對(duì)HSC依賴的造血微環(huán)境研究較少。

正常造血功能依賴于造血干細(xì)胞與骨髓造血微環(huán)境之間的相互作用[5]。近年來越來越多的細(xì)胞和分子水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)，造血干細(xì)胞在造血微環(huán)境各因素的調(diào)控下進(jìn)行增殖、分化、發(fā)育和成熟。骨髓造血微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及基質(zhì)細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子構(gòu)成。基質(zhì)細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種非造血細(xì)胞。位于血管內(nèi)皮附近的MSC作為造血微環(huán)境的重要組成之一[6]，一方面特異性分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞[7]，另一方面維持造血干細(xì)胞功能[8]。研究證實(shí)，MSC通過其表面的黏附分子以及分泌多種細(xì)胞因子來維持HSC功能，如干細(xì)胞因子（SCF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、白細(xì)胞介素（IL）等[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)接受亞致死劑量γ射線照射的小鼠給予具有健脾益腎、滌痰降濁、活血散結(jié)功效的中藥復(fù)方抗衰片，以期達(dá)到調(diào)控造血微環(huán)境進(jìn)而調(diào)控HSC功能之效。結(jié)果顯示小鼠接受射線照射后，骨髓HSC及造血微環(huán)境均受損，脾臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀造血灶，即內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)（CFU-S）。脾結(jié)節(jié)反映了HSC的功能，代表機(jī)體造血功能恢復(fù)的能力[11]。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)均高于照射對(duì)照組，提示抗衰片能夠促進(jìn)髓外脾臟造血功能，促進(jìn)造血恢復(fù)。CFU-GM反映了HSC自我更新能力的大小。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)劑量組的CFU-GM數(shù)目均顯著大于照射對(duì)照組，說明抗衰片可以促進(jìn)機(jī)體造血功能的恢復(fù)。骨髓MSC經(jīng)體外培養(yǎng)可以形成CFU-F，而MSC為分泌造血因子的主要細(xì)胞成分，說明CFU-F在一定程度上可以間接反映機(jī)體造血微環(huán)境的情況[12-13]。本研究的中、高劑量組CFUF集落形成能力顯著高于照射對(duì)照組，提示抗衰片能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞MSC的增殖能力，對(duì)改善造血微環(huán)境起到一定的作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能直接證實(shí)抗衰片是通過調(diào)控造血微環(huán)境的功能，從而調(diào)控HSC增殖的作用。為此本課題組進(jìn)行了MSC與HSC體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（2D CFU-GM）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量組2D CFU-GM增殖能力顯著高于照射對(duì)照組，提示抗衰片可能是通過增強(qiáng)MSC功能從而改善造血微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)HSC功能的恢復(fù)。

綜上所述，抗衰片可以通過增強(qiáng)輻射損傷后造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞MSC功能，改善造血微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控HSC功能，重建造血功能。其中，中劑量組效果比較顯著。抗衰片調(diào)控造血微環(huán)境進(jìn)而調(diào)控造血功能的具體作用機(jī)制目前尚未闡述清楚，因此后續(xù)研究需要進(jìn)一步從分子水平進(jìn)行探討。

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（2015-09-02收稿2015-11-05修回）

（本文編輯李鵬）

The effects of KS tablet onhematopoietic regulation inmice treated with radiation

KANG Xiaomeng, WANGhuawei, DU Liqing, ZHAO Jie, ZHANG Yurui, WANGhua′nan, YANG FujunΔ, XU WenqingΔ
Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science & Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail：fjyang32@126.com; xuwenqing@irm-cams.ac.cn

Abstract：Objective To investigate the effects of Kangshuai (KS) tablet on thehematopoietic reconstitution inmice treated with radiation.Methods C57BL/6mice were randomly divided into four groups: irradiated control group, low-dosebook=60,ebook=65group (0.75 g/kg),middle-dose group (1.5 g/kg) andhigh-dose group (3.0 g/kg).There were tenmice for each group.Themice in three treated groups were given KS tablet suspension orally for three days before the treatment with irradiation, and the control group was given equal quantity of normal saline.All themice were underwent irradiation of 6.0 Gy137Cs-γ rays, and were continuously given drug suspension or saline for seven days.Themice were sacrificed on the eighth day after irradiation.Colony forming unit of spleen (CSF-S), granulocytemacrophage colony-forming unit (CFU-GM) and fibroblast colony-form?ing unit (CFU-F).The 2D CFU-GMhematopoietic stem cells (HSC) were co-cultured withmesenchymal stem cell (MSC).Re?sults Compared with the irradiated control group, numbers of CFU-GM were significantly increased in three treatment groups.The proliferations of CFU-S, CFU-F and 2D CFU-GM were significantly enhanced inmiddle andhigh dose groups (P＜0.05).Conclusion KS tablet can promotehematopoietic reconstitution inmice after irradiation damage.

Key words：BSKS tablet；radiation injuries；hematopoietic reconstitution；mesenchymal stem cells；hematopoietic stem cells

通訊作者ΔE-mail：fjyang32@126.com；xuwenqing@irm-cams.ac.cn

作者簡介：康肖夢(mèng)（1989），女，碩士在讀，主要從事造血系統(tǒng)輻射損傷防治研究

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273005）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC36400）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所所基金（SF1528，SF1533，ST1552）

中圖分類號(hào)：R285.5，R818.74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150143

作者單位：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所（郵編300192）