固定化脂肪酶的研究進(jìn)展

王昊楠　張培培　楊文健

摘 要： 將脂肪酶固定化，可以提高酶的專一性及穩(wěn)定性等，使酶的性質(zhì)更加穩(wěn)定，且反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，易于分離。本文綜述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共價(jià)交聯(lián)法和包埋法等，研究了不同的固定化方法對(duì)酶的性質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞： 脂肪酶 固定化 方法

脂肪酶（又稱甘油酯水解酶）是一類廣泛用于催化甘油三酯水解的酶類。除了具有水解的功能外，它還可以催化醇解、酯化、酯交換等反應(yīng)，但在實(shí)際使用過(guò)程中，游離脂肪酶存在易失活、催化反應(yīng)不穩(wěn)定、與產(chǎn)物分離困難或分離成本高等缺點(diǎn)[1]，因此限制了脂肪酶的進(jìn)一步應(yīng)用，然而通過(guò)選擇合適的載體及固定化方法，將脂肪酶固定化，可以有效解決上述問(wèn)題。本文介紹了近幾年不同學(xué)者研究脂肪酶固定化的方法和研究成果，以期為固定化脂肪酶的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1.固定化脂肪酶的方法

1.1吸附法

吸附法通過(guò)氫鍵、疏水鍵、電子親和力等分子間作用力完成酶的固定[2]。吸附法具有工藝簡(jiǎn)單、酶殘余活力高、載體材料豐富的特點(diǎn)。

王冰[3]等以沙蒿多糖-殼聚糖復(fù)合磁性微球?yàn)檩d體，采用物理吸附法固定化脂肪酶，對(duì)固定化過(guò)程中對(duì)酶活力有影響的各種因素進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)固定化酶的部分理化性質(zhì)、最適IR、溫度、酶的熱穩(wěn)定性和表觀米氏常數(shù)等與游離酶做了比較。確定固定化脂肪酶的最佳條件為每 0.1g 載體加 2%（w/v）的酶溶液0.9 ml，固定8h，pH 8.4，溫度為50℃。

縱偉[4]等以磁性殼聚糖微球?yàn)檩d體，用物理吸附法固定化脂肪酶，對(duì)影響固定化的各種因素進(jìn)行考察，確定固定化的最適宜條件為加酶量600 U/g，溫度5℃ ，pH 7.0，固定時(shí)間 2h，固定化酶連續(xù)使用5 次，其相對(duì)酶活仍為使用前的57.8% ，具有較好的操作穩(wěn)定性。

Liu等[5]采用吸附法將脂肪酶固定在經(jīng)四乙氧基硅烷修飾的磁性納米顆粒上，并用此催化橄欖油和甲醇制備生物柴油，發(fā)現(xiàn)在室溫條件下，當(dāng)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、轉(zhuǎn)速為200rpm、醇油比4：1時(shí)，反應(yīng)12h后生物柴油的產(chǎn)率可達(dá)70%。

Kuo等[6]以磁性殼聚糖微球?yàn)檩d體，N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺為交聯(lián)劑制備固定化脂肪酶，利用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)固定化時(shí)間為2.14h，pH為6.37，酶與載體的質(zhì)量比為0.73時(shí)。固定化脂肪酶脂的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均比游離酶有所提高，重復(fù)使用20次后，仍然保持83%的初始酶活力。

程娟[7]以脂肪酶為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響脂肪酶固定化的因素進(jìn)行分析，并結(jié)合響應(yīng)面方法確定最佳工藝條件為：硅烷化試劑添加量 0.35%，硅藻土與酶的質(zhì)量比 3.5：1，溫度 29 ℃和時(shí)間 4.5h，固定后的脂肪酶活力為206.67 U·g-1。

1.2包埋法

酶的包埋是將脂肪酶捕獲到聚合物內(nèi)部空隙或微囊中的方法。

李剛銳[8]利用溶膠-凝膠法固定脂肪酶，選用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS 4 種硅烷試劑對(duì)黑曲霉脂肪酶進(jìn)行了固定化研究。確定固定化的最佳配方為ETMS/TMOS = 5∶1，水與硅烷試劑分子比為8；最適反應(yīng) pH為pH 4.0， 固定化脂肪酶最適反應(yīng)溫度為 60℃，較游離脂肪酶提高了 10℃；延長(zhǎng)了固定化脂肪酶的使用壽命，提高了保存穩(wěn)定性，使用12次后仍能夠保留 71.7%活性。

虞鳳慧等[9]以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合載體，研究包埋法固定化畢赤酵母高溫堿性脂肪酶。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了不同因子對(duì)脂肪酶固定化的影響，確定包埋法固定化脂肪酶的最優(yōu)條件為海藻酸鈉含量1.0%、羧甲基纖維素鈉含量0.25%、加酶量50 U/（g載體）、CaCl2濃度0.4 mol/L，固定化時(shí)間40 min。在此條件下，酶活回收率高達(dá)99.50%。

1.3共價(jià)鍵結(jié)合法

共價(jià)鍵結(jié)合法是先在載體上引進(jìn)一個(gè)活潑基團(tuán)，然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上的某一基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的方法。

Xu 等[10]研究了將豬胰脂肪酶固定在氨基修飾的 SBA-15 上，結(jié)果表明氨基修飾的 SBA-15 固定化酶具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，重復(fù)使用五次后酶活性仍達(dá)到初始時(shí)的 49.2%。

Hu等[11]在 SBA-15上分別修飾三種不同的基團(tuán)，形成 COOH-IL-SBA、CH3-IL-SBA、NH2-IL-SBA 載體對(duì)洋蔥假單胞菌脂肪酶的固定化進(jìn)行研究。結(jié)果表明NH2-IL-SBA 固定化酶的水解活性最高，能達(dá)到 SBA-15 固定化酶活性的12.39 倍。

Yang等[12]制備了羧基功能化離子液體修飾的 SBA-15，用來(lái)固定豬胰脂肪酶。結(jié)果顯示，羧基功能化離子液體修飾的 SBA-15 對(duì)脂肪酶的固定化效率高達(dá) 95% 以上，遠(yuǎn)高于相同條件下的傳統(tǒng) SBA-15 的酶固定化效率。

1.4其他方法

黃磊[13]等研究了泡沫陶瓷的孔徑分布和表面性質(zhì)對(duì)脂肪酶固定化的影響。泡沫陶瓷用硅烷偶聯(lián)劑對(duì)其進(jìn)行表面改性處理后，成功地應(yīng)用于脂肪酶的固定化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泡沫陶瓷的納米孔孔徑分布非常適合脂肪酶的固定化，對(duì)固定化酶的催化效率有決定性影響。

曲偉光等[14]以氯乙?；郾揭蚁┪⑶蜉d體為大分子引發(fā)劑，以甲基丙烯酸縮水甘油酯和親水性丙艦胺為共聚接枝單體，以氯化亞銅及2，2′-聯(lián)吡啶為催化體系，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成了具有柔性鏈的親水梳狀環(huán)氧載體PS-acyl-P（AM-co-GMA），讓此固定化酶催化對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯的水解，連續(xù)進(jìn)行7次間歇操作，仍保留初始活性的73.5%；于4℃保存60d，酶活剩余86.8%。經(jīng)親水梳狀環(huán)氧體載體柔性固定化后，該脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性也比較好。

2.展望

以上綜述了吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法固定化脂肪酶研究的新進(jìn)展。吸附法操作簡(jiǎn)單，載體種類豐富，但脂肪酶與載體的結(jié)合通過(guò)物理吸附，連接不緊密，容易脫落；包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)， 酶活回收率較高，可應(yīng)用于許多酶、微生物和細(xì)胞器的固定化；共價(jià)鍵結(jié)合法與吸附法相比反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，會(huì)改變或破壞部分酶的活性中心，使活力回收率較低， 但是酶與載體結(jié)合較牢固，酶不易脫落，穩(wěn)定性好。如何克服單獨(dú)使用這些方法的缺點(diǎn)成為應(yīng)用固定化酶的主要障礙。希望未來(lái)，隨著固定化技術(shù)的研究，載體材料選擇及改性方法的成熟，吸附法能夠更好地與包埋法、化學(xué)法等結(jié)合發(fā)展固定化脂肪酶技術(shù)，讓該項(xiàng)技術(shù)能夠更好更方便地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

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