生物制造研究進展*Recent Advances in Biological Manufacturing

歐陽平凱,馮　嬌,許　晟,王　昕,陳可泉

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京　211816)

生物制造研究進展*Recent Advances in Biological Manufacturing

歐陽平凱**,馮嬌,許晟,王昕,陳可泉

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816)

摘要：近年來，生物制造(Biological Manufacturing)已成為社會可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。合成生物學(xué)等生物技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了生物質(zhì)原料的利用效率，改善了人工合成生物催化劑性能，為生物制造在醫(yī)藥、材料及燃料化學(xué)品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。本文從醫(yī)藥、材料、燃料化學(xué)品方面介紹生物技術(shù)的進步給生物制造帶來的變革，并對合成生物學(xué)在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用進行展望。

關(guān)鍵詞：生物制造合成生物學(xué)醫(yī)藥材料燃料化學(xué)品

0引言

當(dāng)前，全球生物經(jīng)濟已進入快速成長期，生物制造(Biological Manufacturing)正受到世界各國的廣泛關(guān)注和高度重視。通過生物制造生產(chǎn)醫(yī)藥、材料以及燃料化學(xué)品已經(jīng)取得顯著成績。長期以來，化石資源是支持社會經(jīng)濟發(fā)展的重要因素，而其帶來的資源不可再生和環(huán)境污染等問題卻制約著經(jīng)濟和社會的可持續(xù)發(fā)展。生物制造不僅可以避免傳統(tǒng)化工制造對石油、煤炭等不可再生資源的依賴以及其在制造過程中帶來的環(huán)境污染問題，同時還可以通過生物催化大大降低原料成本、水和能量消耗量，減少污染物排放。生物制造可謂是解決人類社會可持續(xù)發(fā)展瓶頸的有效手段，其中生物技術(shù)的突破是帶動生物制造不斷發(fā)展的核心因素。合成生物學(xué)是新興的多學(xué)科技術(shù)和方法交叉的學(xué)科，是工程學(xué)與生物科學(xué)發(fā)展到現(xiàn)階段的產(chǎn)物，它可以突破自然進化的限制，改造和優(yōu)化現(xiàn)有自然生物體系，甚至從頭合成創(chuàng)建具有特定功能的人工生命體，實現(xiàn)人工生命體在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用，克服傳統(tǒng)化工制造高耗能、高污染的特性，生產(chǎn)傳統(tǒng)化工制造難以高效制造或者產(chǎn)量極低的產(chǎn)品，為生物制造注入新的活力。

1生物制造概述

隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，日益緊張的化石資源和日益加劇的環(huán)境污染迫切需要傳統(tǒng)化工制造模式的革新。生物制造具有低碳循環(huán)、綠色清潔等典型特征，可以突破傳統(tǒng)化學(xué)制造的理念和原理，為我國的可持續(xù)發(fā)展提供關(guān)鍵的革新技術(shù)。

生物制造是以生物體機能進行大規(guī)模物質(zhì)加工與物質(zhì)轉(zhuǎn)化、為社會發(fā)展提供工業(yè)商品的新行業(yè)，是以微生物細(xì)胞或酶蛋白為催化劑進行化學(xué)品合成、或以生物質(zhì)為原料轉(zhuǎn)化合成醫(yī)藥、材料和能源化學(xué)品，促使其脫離石油化學(xué)工業(yè)路線的新模式，主要表現(xiàn)為先進發(fā)酵工程、現(xiàn)代酶工程、生物煉制、生物過程工程等新技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用[1]。

現(xiàn)如今，全球生物經(jīng)濟處于快速發(fā)展時期，生物制造已經(jīng)在生產(chǎn)中大顯身手。據(jù)估計，目前生物制造已用于超過300個工業(yè)生產(chǎn)過程，大部分為氨基酸、維生素、有機酸、醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。如辛伐他丁是一種有效治療高膽固醇的藥物，加利福尼亞州大學(xué)Tang教授研發(fā)了一種使用工程酶和低成本原料合成辛伐他丁的工藝，隨后Codexis公司對其進行優(yōu)化。這項新工藝使得Tang教授和Codexis公司獲得2012年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)的合成路線獎[2]。

經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)提出：“生物催化是工業(yè)可持續(xù)發(fā)展最有希望的技術(shù)?！鄙镏圃斓膶嵸|(zhì)是以生物催化劑來代替化學(xué)催化劑的工藝路線。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物催化劑從自然進化的緩慢改變過程到農(nóng)業(yè)育種時期的加速進化，到現(xiàn)在對分子生物學(xué)、基因工程、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科技術(shù)與理論的不斷成熟，生物催化劑的改造進入極快進化的時代。近年來，隨著合成生物學(xué)研究的不斷深入，生物催化劑開始新的變革。

2合成生物學(xué)在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用

合成生物學(xué)是新興的多學(xué)科技術(shù)和方法交叉的學(xué)科。合成生物學(xué)以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合工程學(xué)的模塊化概念和系統(tǒng)設(shè)計理論，在人工合成DNA的基礎(chǔ)上，進行合理而系統(tǒng)的設(shè)計創(chuàng)建元件、器件或模塊，通過生物學(xué)改造和優(yōu)化現(xiàn)有生物體，甚至從頭構(gòu)建和組裝合成人工生命體[3]。其基本目標(biāo)是設(shè)計并合成人工生命體，解決醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)現(xiàn)在與未來的問題。

合成生物學(xué)已經(jīng)在醫(yī)藥、材料和燃料化學(xué)品等生物制造領(lǐng)域有突出表現(xiàn)。到2025年，合成生物學(xué)將會對藥物、生物燃料等產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，產(chǎn)生約0.7萬億～1.6萬億美元的經(jīng)濟效益[4]。

2.1醫(yī)藥生物制造

我國作為全球第三大醫(yī)藥市場，對醫(yī)藥的需求越來越大，生產(chǎn)技術(shù)作為醫(yī)藥制造產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵因素，在不斷發(fā)展、革新。生物制造為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)帶來新一輪的創(chuàng)新和提高。

生物制造在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用已有很多例子，其中最典型的莫過于Keasling小組在人工細(xì)胞中合成抗瘧疾藥物青蒿素的工作。Martin等[5]和Ro等[6]利用合成生物學(xué)的工具，先后在大腸桿菌和酵母中設(shè)計出其本身不存在的青蒿素前體——青蒿酸的合成途徑，從而可以完全不受自然條件控制，將每一個細(xì)胞當(dāng)作微生物制藥工廠，擺脫自然條件和高成本的生產(chǎn)過程的限制，這不僅將青蒿酸的生產(chǎn)能力提高了100萬倍，而且將其藥物的成本從每劑量10美元降為低于1美元。此外，Stephanopoulos小組[7]于2010年在大腸桿菌中將其自身的異戊烯焦磷酸酯(IPP)合成途徑和異源的紫衫醇前體——紫衫二烯合成途徑這兩個模塊的通量，通過質(zhì)粒拷貝數(shù)和啟動子強度的改變進行微調(diào)和組合，使紫衫二烯的產(chǎn)量提高到1 020 mg/L。2014年，張學(xué)禮課題組[8]利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建了能同時合成齊墩果酸、原人參二醇和原人參三醇3種人參基本皂苷元的第一代“人參酵母”。2015年，用酵母合成阿片類藥物被美國Science雜志評選為10大科學(xué)突破之一。斯坦福大學(xué)合成生物學(xué)家Christina Smolke及其同事通過改造酵母菌，一共表達來源于不用物種的21個基因，使其成功地將糖轉(zhuǎn)化為蒂巴因，蒂巴因是嗎啡等止痛藥的前體，而這種藥物的生產(chǎn)依賴于罌粟的種植，該通路進一步擴展表達兩種酶后可生產(chǎn)氫可酮——一種由蒂巴因化學(xué)合成的止痛藥[9]。

隨著合成生物學(xué)研究的逐漸深入，合成生物學(xué)也必將不斷促進整個醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展。

2.2材料生物制造

材料的開發(fā)是生物制造的一項重要內(nèi)容，它是以可再生的生物質(zhì)資源為原料，利用微生物細(xì)胞或酶的催化功能來生產(chǎn)多種高附加值平臺化合物，這些化合物可經(jīng)進一步加工或者直接使用來生產(chǎn)多種高附加值化工產(chǎn)品。2011年生物基材料的市場大約為120萬t，預(yù)計2016年將增長5倍，達到600萬t，到2020年生物基材料占材料市場份額將從2011年的1.5%提高到3%，而合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展將帶動生物基材料的革新。

生物基聚合單體是合成生物基材料的前體物質(zhì)。如乳酸是自然界最小的手性分子，廣泛存在的羥基酸，是聚乳酸(PLA)合成的原料之一，其D-型和L-型的組成和含量直接影響PLA的物理性質(zhì)和降解性能。一般化學(xué)法合成的乳酸是消旋的DL-乳酸，無法滿足聚乳酸合成需要的極高化學(xué)純度和較高光學(xué)純度的乳酸單體，Zhu等[10]將經(jīng)過aceEF、pfl、poxB、pps突變，同時敲除frdABCD基因的重組菌株E.coli ALS974 經(jīng)兩階段發(fā)酵后，利用葡萄糖產(chǎn)生138 g/L乳酸，轉(zhuǎn)化率達97%。乙二醇是一種重要的基本有機原料，可用于生產(chǎn)聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙二醇(PEG)等，用途廣泛。相較于傳統(tǒng)的石油化工生產(chǎn)工藝，利用生物質(zhì)發(fā)酵制備可降低原料成本，工藝路線也較靈活。劉穎[11]以小麥秸桿為原料，通過系統(tǒng)分析和實驗，采用黃孢原毛平革菌為發(fā)酵菌株，發(fā)酵生產(chǎn)乙二醛，后將乙二醛加氫得到乙二醇，預(yù)處理產(chǎn)率為99.50%、發(fā)酵產(chǎn)率為93.60%、稈轉(zhuǎn)化總產(chǎn)率為29.50%，并且得到的乙二醇質(zhì)量達到國家標(biāo)準(zhǔn)水平，屬于合格產(chǎn)品。丹麥Novozymes 公司利用自己研究的具有水解酶活性的多肽，對預(yù)處理的纖維素進行同步糖化發(fā)酵，最終獲得乙二醇、烷烴、烯烴等產(chǎn)物[12-13]，并向全球最大生物質(zhì)乙二醇生物煉廠——M&G化學(xué)獨家供給酶制劑。

對于一些新型材料單體的研究，如丁二酸，又名琥珀酸，是一個重要的生物基聚合單體，可以用來合成己二酸、1,4-丁二醇、四氫呋喃等大宗化學(xué)品和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)這類可降解生物材料。丁二酸作為三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在大多微生物中存在，其中主要的生產(chǎn)菌株是大腸桿菌，對其的生產(chǎn)途徑研究也很多，主要是通過強化合成丁二酸途徑、抑制或阻斷丁二酸副產(chǎn)物途徑及構(gòu)建丁二酸有氧生產(chǎn)[14-15]。Lee等[16]采用計算機模擬分析后，實驗驗證敲除大腸桿菌與丙酮酸生產(chǎn)相關(guān)的3個酶的基因(ptsG、pykF和pykA)可以提高琥珀酸的產(chǎn)量。Yang等[17]利用計算機模擬分析丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶和PEP羧化酶對琥珀酸產(chǎn)率的影響，分析得到丙酮酸羧化酶對丁二酸的產(chǎn)率影響最大，之后通過補料分批發(fā)酵實驗驗證，得到丁二酸生產(chǎn)強度為2.75 mmol·gDCW-1·h-1。我國973項目“人工合成細(xì)胞工廠”資助的張學(xué)禮課題組[18]通過改變菌株內(nèi)的還原當(dāng)量使得丁二酸產(chǎn)量達到125 g/L，產(chǎn)物對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為105%(部分固定二氧化碳)。戊二胺又名尸胺，是一種生物胺類，在工業(yè)上與二元酸發(fā)生聚合反應(yīng)生成高分子材料——尼龍5.6，是一類優(yōu)質(zhì)的材料，具有良好的機械強度、較高熔點和耐各種有機溶劑的特點[19]。Fritz等[20]建立了在大腸桿菌中由戊二胺誘導(dǎo)合成的戊二胺操縱子調(diào)控機制。King等[21]構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)戊二胺的細(xì)胞工廠，隨后批量生產(chǎn)得到88 g/L戊二胺。Ma等[22]成功構(gòu)建了一株可通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1,5-戊二胺的基因工程菌株，通過融合Erwinia carotovora的pelB信號肽序列，成功將大腸桿菌的戊二胺-賴氨酸的雙向轉(zhuǎn)運蛋白(CadB)在膜上表達，使菌體攝取L-賴氨酸和外排1,5-戊二胺的能力顯著提高，單位菌體的1,5-戊二胺產(chǎn)量提高2.3倍，通過優(yōu)化L-賴氨酸分批補料供給，1,5-戊二胺產(chǎn)量達到221 g/L。

以上生物基聚合單體的生產(chǎn)瓶頸都是生產(chǎn)強度較低，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，人們對生產(chǎn)菌株代謝和調(diào)控的認(rèn)識不斷深入，技術(shù)手段不斷進步，通過改造或構(gòu)建高效的生產(chǎn)菌株，將大大提高生物基聚合單體的合成效率，推動生物制造業(yè)的發(fā)展。同時也為直接利用生物技術(shù)生產(chǎn)聚合物提供更廣闊和有利的手段。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種生物可再生、生物可降解、生物相容性好的高分子聚合物，其單體也非常多，所以結(jié)構(gòu)多樣，包括由單一單體聚合而成的均聚物和由兩種或兩種以上單體形成的共聚物，其中，共聚物又可分為無規(guī)共聚物和嵌段共聚物。Zhang等[23]通過構(gòu)建反式脂肪酸β-氧化途徑，實現(xiàn)大腸桿菌以葡萄糖為唯一碳源生產(chǎn)中長鏈PHA(mcl-PHA)，之后通過刪除硫酯酶，構(gòu)建來源于Pseudomonas stutzeri 1317的PHA合成酶，可以合成12.10 wt%細(xì)胞干重的單體比例不同的短鏈中長鏈PHA共聚物(scl-mclPHA)。3-羥基丙酸與4-羥基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)是一種PHA材料的嵌段共聚物，即由兩個或兩個以上單體共價連接。Meng等[24]利用合成生物學(xué)方法在大腸桿菌中構(gòu)建一條合成P(3HP-co-4HB)的通路，通過異源表達醇脫氫酶、醛脫氫酶、輔酶A連接酶、4-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、PHA合酶5個基因，實現(xiàn)大腸桿菌利用1,3-丙二醇和1,4-丁二醇為碳源合成P(3HP-co-4HB)，并可以通過控制單體比例來調(diào)節(jié)聚合物。聚乳酸是生物可降解的脂肪族聚酯類高分子材料，屬于熱塑性硬性材料，可用于面包、果蔬包裝、枕頭填充物、無紡布等領(lǐng)域，應(yīng)用廣泛。Jung等[25]在大腸桿菌中引入異源代謝途徑實現(xiàn)聚乳酸均聚物PLA及羥基丁酸與乳酸的共聚物P(3HB-co-LA)的直接合成，之后進一步改造大腸桿菌——敲除ackA,ppc和 adhE基因，將ldhA和acs基因的啟動子替換成trc啟動子，使其可以葡萄糖為碳源生成11 wt%的PLA，在包含55～86 mol%乳酸情況下，可以利用葡萄糖和3HB生成56 wt%的P(3HB-co-LA)。

2.3燃料化學(xué)品生物制造

全球，尤其是發(fā)展中國家，現(xiàn)如今已進入經(jīng)濟發(fā)展與污染治理不協(xié)調(diào)時期，化石資源日益枯竭，國際能源市場價格波動，溫室氣體的排放造成環(huán)境日益惡化，尋求綠色清潔的可再生能源成為各國關(guān)注的重點，生物燃料可以作為替代燃料，有著良好的發(fā)展前景。傳統(tǒng)的生物燃料以糧食作物為原料，存在“與人爭糧”和“與糧爭地”的問題，因此開發(fā)以非糧生物質(zhì)為原料，進行可持續(xù)性的先進生物燃料的制造越來越重要。木質(zhì)纖維素是一類農(nóng)業(yè)廢棄物，可作為發(fā)酵碳源，經(jīng)過處理水解后，產(chǎn)物有六碳糖(如葡萄糖、甘露糖等)和五碳糖(如木糖、阿拉伯糖等)，如何利用五碳糖是現(xiàn)在纖維素乙醇的關(guān)鍵研發(fā)問題之一。Wisselink等[26]在啤酒酵母中引入植物乳桿菌的阿拉伯糖途徑，使得乙醇產(chǎn)率達到0.29 g/(g·L)。Wei等[27]則將五碳糖、六碳糖利用和乙酸還原途徑整合到釀酒酵母中，這些研究都為木質(zhì)纖維素的利用打下良好基礎(chǔ)。異丁醇可作為一種具有巨大潛能的汽油替代燃料，Higashide等[28]從腐爛的草中分離到一株梭菌Clostridium cellulolyticum，通過構(gòu)建工程的纈氨酸合成途徑可以直接從丙酮酸生產(chǎn)異丁醇，再利用宿主自身的纖維素分解途徑和氨基酸合成途徑等使其可以直接利用纖維素合成異丁醇，產(chǎn)量達到660 mg/L。Steen等[29]利用合成生物學(xué)方法改造大腸桿菌，使其無需化學(xué)改質(zhì)直接從單糖生產(chǎn)脂肪酸酯(生物柴油)、脂肪醇和蠟，在此基礎(chǔ)上在大腸桿菌中引入半纖維素代謝模塊，使其可以利用自身生產(chǎn)的脂肪酸生產(chǎn)生物燃料，有利于降低生產(chǎn)成本。林麗華等[30]以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum,gxas18-1)為模板，克隆其丁醇合成相關(guān)基因并導(dǎo)入大腸桿菌，成功構(gòu)建產(chǎn)丁醇的大腸桿菌工程菌。近年來，LS9公司的研究團隊在合成生物學(xué)生產(chǎn)先進燃料方面有突出貢獻，通過對光合自養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌進行重組，使其含有一個脂酰ACP還原酶和烷烴脫羧加氧酶，該重組菌可以利用脂肪酸合成途徑的中間代謝物脂酰ACP為底物合成烷烴類和烯烴類。之后為實現(xiàn)鏈烷烴大規(guī)模生產(chǎn)，他們又將藍(lán)細(xì)菌中與烷烴合成相關(guān)的17個基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建可以生產(chǎn)鏈烷烴酶的重組大腸桿菌[31]。

生產(chǎn)菌株由于本身特性或異源途徑的引入等原因，生產(chǎn)能力低，如何改良自身特性，引入可行途徑，提高生物燃料的開發(fā)效率是現(xiàn)如今研究需要解決的難題，核心途徑是突破生物技術(shù)的創(chuàng)新。合成生物學(xué)位于生物技術(shù)的前沿，無疑會為生物燃料帶來技術(shù)突破。

3展望

將合成生物學(xué)應(yīng)用于生物制造，有利于簡化原料的處理、提高生物質(zhì)產(chǎn)量、增強抗逆境能力，突破傳統(tǒng)制造難以獲得的化學(xué)活性成分的合成，以及環(huán)境友好的制造工藝的開發(fā)等，可謂是生物制造的關(guān)鍵推動技術(shù)。合成生物學(xué)作為未來“顛覆性”技術(shù)，更是成為各國科技發(fā)展的重要戰(zhàn)略。奧巴馬政府發(fā)布的“國家生物經(jīng)濟”藍(lán)圖，將合成生物學(xué)技術(shù)作為推動美國科技創(chuàng)新和經(jīng)濟發(fā)展的主要驅(qū)動者之一。英國政府把合成生物學(xué)視為非常有商業(yè)前景的革命性平臺，熱切期望在合成生物學(xué)領(lǐng)域占據(jù)世界領(lǐng)先地位。我國政府認(rèn)為合成生物學(xué)將帶來技術(shù)推動的新一輪經(jīng)濟增長，努力成為該領(lǐng)域的國際領(lǐng)先者，并制定了合成生物學(xué)戰(zhàn)略路線圖。合成生物學(xué)的發(fā)展，必將為生物制造在更多領(lǐng)域的應(yīng)用帶來重大突破。

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(責(zé)任編輯：陸雁)

OUYANG Pingkai,FENG Jiao，XU Sheng，WANG Xin，CHEN Kequan

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing,Jiangsu,211816,China)

Abstract:Recently,the biological manufacturing has become an important way for the sustainable social development.With the rapid development of biological technology such as synthetic biology,it can greatly improve the efficiency of biomass utilization and the performance of the biological catalyst or build synthetic approaches.It has a good foundation for biological applications in the field of medicine,materials and fuel chemicals.This paper briefly reviewed the contribution of synthetic biology in the biological manufacturing,including medicine,materials and fuel chemicals.Moreover,it gave a prospection on the future development.

Key words:biological manufacturing，synthetic biology，medicine，materials，fuel chemicals

收稿日期：2016-04-11

作者簡介：歐陽平凱(1945-)，男，教授，主要從事生物化工相關(guān)領(lǐng)域的研究。 **通訊作者：E-mail:ouyangpk@njtech.edu.cn。

中圖分類號：Q81

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)02-0097-05

*廣西科技重大專項項目(桂科重1598004-4)資助。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(2):97～101

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-11

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160511.0936.006.html