牛場肥水灌溉對土壤反硝化細菌nosZ基因組成結構和多樣性研究

王婷++劉麗麗++高文萱

摘 要：以河北省徐水縣長期定位施肥試驗田為研究對象，利用末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析和克隆文庫構建，研究了5種施肥處理（清水灌溉CK、無機肥灌溉CF、不同牛場肥水灌溉T4、T5和T11）下土壤中nosZ型反硝化細菌群落多樣性及其群落結構演變。結果表明，不同施肥處理下nosZ型反硝化細菌群落多樣性無顯著性差異，施肥條件對nosZ型反硝化細菌的群落結構無明顯影響，說明本試驗土壤中nosZ型反硝化細菌對施肥不敏感，群落穩(wěn)定。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，nosZ型反硝化細菌主要與假單胞菌屬（Pseudomonas）具有較近的親緣關系。

關鍵詞： nosZ；反硝化細菌；牛場肥水灌溉；T-RFLP；群落多樣性

中圖分類號：S155.4+4 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.004

反硝化作用是微生物在嫌氣條件下進行的硝酸鹽還原過程，在多種微生物參與下，將硝酸鹽亞硝酸鹽逐步還原，最終將氮以一氧化氮（NO）、氧化亞氮（N2O）或分子態(tài)氮（N2）的形式釋放出來的過程[1-3]。反硝化作用微生物主要分布于水體、沉積物和土壤中，由于土壤的環(huán)境更適合微生物的生存[4]，所以反硝化作用主要發(fā)生于土壤中。研究表明土壤因反硝化作用而喪失了20%～30%的氮肥[5]，全球70%的N2O排放來自土壤[6]，Stehfest和 Bouwman[7]指出，施肥農(nóng)田土壤每年釋放N2O-N 和 NO-N 的量分別達到 3.3 和 1.4 Tg。農(nóng)田土壤是重要的溫室氣體[二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）、氧化亞氮（N2O）]的源匯[8]。因此，深入研究農(nóng)田土壤反硝化的作用及其影響因素，可以為我們減少 N2O 的排放找到新途徑，對于保護地球生態(tài)非常重要。

隨著集約化飼養(yǎng)程度的不斷提高，養(yǎng)殖廢物發(fā)酵產(chǎn)生的沼液作為一種優(yōu)質的有機液體肥料進行水肥還田在很多國家和地區(qū)得到應用和推廣[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，相比不施肥和常規(guī)施肥，沼液能夠提高作物質量，影響土壤微生物[11-13]，而液態(tài)牛場肥水灌溉對反硝化微生物的影響幾乎沒有相關報道。

由于nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶催化N2O向N2轉化，將溫室氣體N2O 轉化為無害的 N2，是反硝化細菌的重要酶[2]。目前已有不少研究者通過研究 nosZ 基因的多樣性來探究反硝化細菌的群落結構和多樣性，比如Ruiz-Rueda 等[14]通過對nosZ的 PCR-DGGE 研究，發(fā)現(xiàn)植被存在可以促進微生物的硝化和反硝化作用。Enwall 等[15]發(fā)現(xiàn)長期施用有機肥改變了 nosZ型反硝化細菌的群落結構，提高土壤的反硝化潛勢。

筆者以河北省徐水縣長期定位試驗田為研究對象，利用T-RFLP和構建克隆文庫方法，探明了按當?shù)剞r(nóng)民習慣施肥以及不同灌溉次數(shù)、不同濃度的牛場肥水灌溉的施肥方式下，冬小麥/夏玉米大田0～5 cm土層中nosZ型反硝化細菌群落的多樣性和組成變化，為深入探討牛場肥水灌溉施肥對大田反硝化作用影響提供相應依據(jù)，并為大田合理施肥、提高牛場肥水灌溉效果以及減少 N2O 的排放提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗設計與土壤樣品采集

本試驗以徐水縣梁家營長期定位施肥試驗田為研究對象。徐水縣地處太行山東麓，河北省中部，北緯38°09′～39°09′，東經(jīng)115°19′～115°46′，屬大陸性季風氣侯，年平均氣溫11.9 ℃，年均降水量546.9 mm，年日照時數(shù)平均2 744.9 h。

試驗田每個小區(qū)長9 m，寬6 m，面積54 m2，四周1 m土體內(nèi)用塑料布隔開，種植方式為冬小麥/夏玉米輪作。共設5個處理，施肥方式及灌溉肥水沼液原液成分見表1和表2。

土壤樣品在小麥收割后（6月中旬）進行采集，采用5點法采集土樣，每個小區(qū)隨機選取5點采集0～5 cm的表層土，去除根系、雜草、土壤動物和石塊等雜質后混勻，于20 ℃冰箱保存。

1.2 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物總DNA的提取方法和步驟按照土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNAR SPIN Kit For Soil （MP Biomedicals，LLC）的說明進行。將提取的DNA用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）測定濃度及質量，于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 末端限制性酶切片段多態(tài)性（T-RFLP）

按照表3進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進行純化回收，并用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）檢測純化產(chǎn)物濃度及質量。產(chǎn)物回收后，擴增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HhaⅠ（TaKaRa）進行酶切，反應體系和條件按各內(nèi)切酶說明書進行。將酶切產(chǎn)物送去生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

通過計算Shannon-Wienner、Simpson和Pielou多樣性指數(shù)模型獲得nosZ型反硝化細菌群落多樣性指數(shù)。

1.4 克隆及測序分析

將1.3目的條帶分別進行切膠回收，用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進行純化，純化后的產(chǎn)物分別與pMD19R-T Vector載體進行連接反應。

將10 μL連接產(chǎn)物分別轉化到100 μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)后進行藍白斑篩選，挑取白斑克隆子，用通用引物M13F（5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′，TaKaRa），M13R（5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′，TaKaRa）進行菌落PCR擴增，選取大約100個克隆子擴大培養(yǎng)后送去生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。