植物體細胞胚發(fā)生的激素調(diào)控

曹劼

（福建省將樂縣林業(yè)局 353300）

植物體細胞胚發(fā)生的激素調(diào)控

曹劼

（福建省將樂縣林業(yè)局 353300）

隨著生物科技的不斷發(fā)展，植物體細胞胚胎發(fā)生的技術隨之興起，該技術的應用不僅讓植物快速繁殖的目標得以實現(xiàn)，同時為植物胚胎發(fā)生機理、遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的形成提供了幫助。本文通過植物五大激素對植物體細胞胚胎發(fā)生的調(diào)控及其作用機制的介紹進一步對其研究進展進行探討。

植物激素；體細胞胚發(fā)生；調(diào)控；發(fā)生機制

1 前言

一般情況下可以將植物體細胞發(fā)生（Somatic Embryogenesis）理解為在對體細胞進行離體培養(yǎng)時，不和性細胞進行融合，利用與受精卵相似的方式構成新個體形體的演變過程，通過細胞胚產(chǎn)生的胚胎結構，可以將其稱為胚狀體或者體細胞胚（本文下面簡稱體胚）。從20世紀50、60年代開始，Steward、Reinert等研究學者分別從胡蘿卜懸浮細胞系、固體培養(yǎng)的胡蘿卜愈傷組織中獲取體胚后，相關學者在就在該新領域展開了大量研究并取得顯著的成果。體胚發(fā)生的研究進展迅速，在2000年前就果樹方面而言，已有28科43屬93種雜種的果樹在離體條件下形成了體胚。

2 植物激素調(diào)控體細胞胚胎發(fā)生

近年來對激素調(diào)控體胚發(fā)生的研究進展迅速，但這種調(diào)控十分復雜，比如多種植物激素發(fā)生的生理作用具備一定的專一性，但是其各異的生理效應是由于不同類型激素間的相互作用產(chǎn)生的。同一激素能對多個發(fā)育的進程進行調(diào)控，并且其同種特性的發(fā)育過程中需要由多種不同的激素相互協(xié)作，同時各種激素對不同植物及同一植物不同階段的體胚發(fā)生作用各異。合理使用相應激素對體胚發(fā)生起重要調(diào)控作用。

2.1 生長素與細胞分裂素對體胚發(fā)生的調(diào)控

自1928年荷蘭F.W.溫特從燕麥胚芽鞘尖端分離出一種具生理活性的物質(zhì)稱為生長素以來，隨著研究的進展，生長素被廣泛用于相關研究中，本章節(jié)將就此對生長素和細胞分裂素給體胚開展調(diào)控進行綜述。通常情況下會認為,生長素是誘導體胚發(fā)生的關鍵因素。常用的生長素有IAA，NAA和2,4-D。其中2,4-D在胚性愈傷組織的誘導中起著重要作用，對多種類型植物組織進行脫分化培養(yǎng)過程中必須使用2,4-D進行調(diào)控，其中尤以需要較高濃度的2,4-D單子葉植物最為突出。細胞分裂素主要是通過促進細胞分裂而促進體胚生長，最常用的細胞分裂素有KT和6-BA。Gaj對不同物種利用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導體細胞胚的基本情況進行了分析和統(tǒng)計，并研究情況指出其中有80%的植物能夠通過生長素單獨誘導或與細胞分裂素相結合的方式進行體胚的誘導；同時明確提出在多數(shù)的研究中會使用2,4-D。另外在多項對植物體細胞胚發(fā)生研究的過程中都會利用生長素和細胞分裂素相結合的方式，使其誘導體胚得以順利進行。

多數(shù)植物的體細胞胚發(fā)生都需要通過生長素和細胞分裂素結合的方實現(xiàn)。只添加生長素能讓胡蘿卜體細胞胚被誘導，而再次添加濃度較低的玉米素則能使其發(fā)生率被大幅度提升并實現(xiàn)同步化。例如2,4-D和KT的比例不同時，都會對植株再生途徑產(chǎn)生影響，當培養(yǎng)基中為0.1mg/L2,4-D時該結果更傾向于體細胞胚的發(fā)生,當為0.2mg/LKT和0.1mg/L2,4-D時則會利于器官發(fā)生。在DKW的培養(yǎng)基中附加6-BA1.1mg/L和KT2.0mg/L以及IBA0.01mg/L時，對于核桃愈傷組織的誘導有著顯著效果,而當其培養(yǎng)基中只含細胞分裂素時,使核桃體細胞胚的發(fā)生容易被誘導。相關研究學者根據(jù)其特性配置了15種不同配比的激素組合，并對利用2,4-D和BA等對百合鱗片葉器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生進行研究,最終試驗結果顯示:利用MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，BA主要是對植體直接分化不定芽進行誘導；而2,4-D則對體細胞胚胎發(fā)生直接進行誘導,當2,4-D濃度為4.0mg/L時，其體細胞胚胎發(fā)生的誘導效果最好；而當培養(yǎng)基中同時存在BA和2,4-D時,兩種現(xiàn)象都會出現(xiàn)。

2.2 脫落酸ABA對體胚發(fā)生的調(diào)控

在進行植物體細胞胚胎發(fā)生的過程中脫落酸有著重要的作用，也是其中的重要激素。據(jù)研究結果顯示，使體細胞胚得以成熟關鍵因素是ABA，其作用在于能讓細胞胚快速成熟，避免出現(xiàn)裂生多胚的情況，進而造成畸形胚。早在1974年,Ammirat就關于ABA能促使葛縷子（CarumcarviL.）體細胞胚胎快速發(fā)育進行了報道。而Kamada等研究人員在進行胡蘿卜細胞培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)其ABA含量一直處于偏低的狀態(tài),但是由非胚性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约毎蛷呐咝约毎麍F發(fā)育形成有形態(tài)結構的球形胚兩個質(zhì)變發(fā)生階段中,ABA的含量均有所增加。根據(jù)唐巍等研究人員的實驗顯示：在對針葉林木體胚發(fā)生進行研究中ABA有著重要影響，因此在進行體胚分化培養(yǎng)中添加ABA能使體胚發(fā)育成熟率加快。過去ABA主要是用于加快野蒿（Artemisia campestrisL.）和大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）的體細胞胚成熟中。而近年來 Fowke和Attree研究人員發(fā)現(xiàn)，當使白云杉（Picea glauce（Moeach）Voss.） 未成熟體細胞胚放置在 ABA （16～22μmol·L-1）和PEG4000（7.5%）的組合物中一段時間后，不僅能有效的抑制早熟萌發(fā)，對于成熟頻率的提升和形成較高質(zhì)量的胚有著重要影響。并且該結論和廖宇賡進行臺灣云杉（Picea morrisonicola Hayata）試驗的結果相似。此外相關研究顯示，在對防風體細胞胚進行培養(yǎng)的過程中，添加,附加0.5-1.0mol/LABA，能讓次生胚的形成被成功移植，同時避免了畸形胚狀體的發(fā)生。陳金慧等在雜交鵝掌楸體細胞胚胎研究中指出ABA的使用能有效控制畸形胚的產(chǎn)生。研究表明，不管是外源ABA與內(nèi)源ABA都能使體細胞胚發(fā)生實現(xiàn)調(diào)節(jié)和促進作用，通過添加4.0μmol/L外源ABA的方式使體細胞胚發(fā)生頻率與質(zhì)量明顯提升。

根據(jù)Dennis等的實驗顯示,當在含有200mmol/L蔗糖的培養(yǎng)基中添加2mol/LABA時，能讓其體細胞胚的數(shù)量得到有效的提升，和王清連等研究結果具有一致性。但是在魏岳榮等研究中發(fā)現(xiàn)當在香蕉體細胞胚誘導初期時添加一定濃度ABA時，會使體細胞胚的發(fā)生受到移植,嚴重者讓其在萌發(fā)時出現(xiàn)嚴重的愈傷化。此項研究差異還需進一步進行說明。

2.3 赤霉素對體胚發(fā)生的調(diào)控

赤霉素在植物組織培養(yǎng)中研究較多的是具有生理活性的GA1、GA3。其突出的作用是加速細胞的伸長，提高植物體內(nèi)生長素的含量，對細胞的分裂有促進作用，并促進細胞的擴大。由于很多植物在無赤霉素的情況下都能生成體胚，可能其內(nèi)源GAs能夠滿足體胚發(fā)生需要。因此，關于赤霉素（GAs）調(diào)節(jié)體胚發(fā)生和發(fā)育的報道較少。

吳蝴蝶等研究指出GA3在橡膠體細胞胚萌發(fā)成苗中起重要作用，其用量在0.5～1mg/L較合適,不宜超過2mg/L。根據(jù)張寶紅等研究證實，當培養(yǎng)基中GA3含量較高時，會出現(xiàn)陸地棉畸形胚的情況發(fā)生，這對于植物體細胞胚發(fā)生來說是極為不利的。而赤霉素在對蘋果、梨、紅醋栗、櫻桃等果樹的體胚發(fā)生中有著積極作用同時,在柑橘中則會出現(xiàn)利弊并存的現(xiàn)象。

2.4 乙烯對體胚發(fā)生的調(diào)控

在植物體能廣泛分布且能起到調(diào)節(jié)作用的是乙烯和多胺等物質(zhì)。因為在實驗過程中的組織培養(yǎng)時處于密封或半密封的容器中，這就使得乙烯的積累不能被避免，并且對于體胚發(fā)生和發(fā)育有著一定的影響。乙烯雖然對胡蘿卜愈傷組織中的體胚發(fā)生有著抑制作用，但是該物質(zhì)產(chǎn)生的抑制劑，例如Co2+、Ni2+等能讓乙烯的產(chǎn)生被抑制的同時使胡蘿卜體胚發(fā)生率被提升。多胺對于DNA負電荷有著中和效果,并且能使其結構相對穩(wěn)定,其DNA結構的穩(wěn)定程度跟體細胞胚發(fā)生與發(fā)育的遺傳基礎的情況有著一定的聯(lián)系。多胺對于體胚發(fā)生的促進和制止乙烯合成有著一定的聯(lián)系。當將乙烯和多胺生物進行融合時能有效的對體胚的發(fā)生和發(fā)育進行調(diào)控。有些研究表明乙烯對體胚的發(fā)生有著利弊影響,同時也有相關研究顯示當植物的品種或材料的胚性強弱不同時，其影響也就不同,并且還有研究顯示,乙烯不會對體胚的發(fā)生造成顯著的影響。黃學林等研究得出：乙烯抑制體細胞胚發(fā)生,但能促進體細胞胚的成熟。當體細胞胚的種類和發(fā)育階段存在一定的差異時，其培養(yǎng)容器中累積的乙烯產(chǎn)生的利弊效果也會不同。造成這些結果存在差異性的原因和物種以及處理方式差別有著一定的聯(lián)系，同時乙烯的量也有著一定的影響，該物質(zhì)的具體作用機理還需要由相關人員進一步研究分析。

3 激素調(diào)控體細胞胚胎發(fā)生的機制

在植物體細胞的發(fā)生過程中植物激素不是直接作為生長素而存在的，而是需要利用內(nèi)源激素含量變化發(fā)揮作用。相關研究有結果顯示：2,4-D主要是利用細胞內(nèi)源IAA代謝而發(fā)生的，其內(nèi)源性IAA含量的上升或維持在較高的水平是胚性細胞出現(xiàn)的一個共同標志。據(jù)相關的學者研究顯示，將胡蘿卜組織置于培養(yǎng)中，外源2,4-D有利于內(nèi)源IAA大量積累，胡蘿卜細胞胚胎發(fā)生的能力與內(nèi)源IAA水平的升高密切相關。一些激素通過影響DNA甲基化程度，由于甲基化能夠影響基因的失活和表達，從而影響體胚的發(fā)生。理想狀態(tài)下的DNA甲基化水平有利于正常的體胚發(fā)育,但是當DNA甲基化程度過高或過低使都會迅速對體胚發(fā)生造成抑制，Loschiavo等觀察到，2,4-D的濃度與否和細胞核DNA甲基化情況有著直接聯(lián)系，當將胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)在含高濃度2,4-D的培養(yǎng)條件中時，其細胞核DNA甲基化也會隨之增加，而基因表達活性則會下降；當除去或降低2,4-D濃度時，其細胞核DNA的甲基化會明顯降低，進而使相應的基因被激活。

就體細胞胚胎發(fā)生本質(zhì)而言主要是因為體細胞受到各種內(nèi)外因素的影響,進而使某些特異基因的表達被開啟,主要體現(xiàn)為胚性蛋白的產(chǎn)生。在體細胞胚形成中植物激素有著一定的有調(diào)節(jié)作用，促進或抑制相關基因的表達，從而實現(xiàn)對體胚發(fā)生的調(diào)控。在胡蘿卜的各種基因中Dcarg-1會受到生長素調(diào)控的影響,并且只處于誘導前期進行表達,由此可見生長素處理能夠形成一種脅迫環(huán)境,容易造成觸發(fā)體胚的發(fā)生。在對煙草細胞進行懸浮培養(yǎng)過程中，利用2,4-D對生長素饑餓的細胞進行處理，并在15～30min后，其中的mRNA開始積累，經(jīng)過cDNA文庫進行差異性篩選后，得出7種2,4-D誘導的mRNA，其中有3種屬于生長素初期應答基因，學者根據(jù)這個結果判斷編碼的蛋白可能與細胞分裂的起始有一定的聯(lián)系。目前,與胚發(fā)育密切相關的基因有（LEA）基因、體胚分泌蛋白基因、胚根發(fā)育相關基因、脂體跨膜蛋白基因、（SERK）基因、與翻譯有關的延伸因子EF21的基因等。這些基因中的大多數(shù)會因為外源激素造成影響，進行出現(xiàn)差異的表達。LEA基因編碼中的LEA蛋白屬于在胚胎發(fā)生后期種子中占比較大的一系列蛋白質(zhì)，容易因為ABA和脫水信號的影響，并且能在種子脫水過程中對其胚胎的保護。Kim等研究學者對苜蓿的高胚性和低胚性進行培養(yǎng),最終結果顯示NAA也許是對MtSERK1的上游正進行調(diào)控的物質(zhì),而BAP則是利用NAA的作用使NAA誘導效果被提升，2,4-D也可能參與了胡蘿卜和鴨茅培養(yǎng)時的SERK基因表達調(diào)控。

4 體細胞胚發(fā)生存在的問題及展望

目前對植物體胚發(fā)生研究雖然取得較大的進步，并且其部分的研究成果在園藝和林業(yè)等生產(chǎn)中得到應用。但是實際的應用和研究過程中仍有問題存在。比如體胚轉(zhuǎn)換率的提高和體胚發(fā)生的遺傳穩(wěn)定程度的控制力度以及體胚發(fā)生的分子機理等方面的問題有待處理和探討。與此同時,為了使體細胞胚發(fā)生的實質(zhì)得以體現(xiàn)，需要對其體細胞胚發(fā)生的分子機制進行深入研究,其中尤以離體培養(yǎng)狀態(tài)下細胞分化時基因差異的表達和機理的調(diào)控等，而高通量測序技術的不斷發(fā)展將為其研究帶來更大的方便。

Q944.46

A

1005-7897（2016）02-00103-02

2016-1-9