糖痹康對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)p38絲裂素活化蛋白激酶及血漿腫瘤壞死因子—α表達(dá)的影響

呂翠巖　張勝容　徐暾?！O文　趙文景　張竹華　鄭桂敏　孟元　王暉　劉銅華

摘要：目的 觀察中藥復(fù)方糖痹康對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)p38絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）及血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)及鎮(zhèn)痛機(jī)制。方法 SD雄性大鼠60只，隨機(jī)選取10只為正常組，其余大鼠采用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素誘發(fā)2型糖尿病大鼠模型。成模后隨機(jī)分為模型組、甲鈷胺組和糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)。16周后取大鼠一側(cè)坐骨神經(jīng)，放免法檢測(cè)大鼠血漿TNF-α含量；Western blot檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)p38、p-p38蛋白表達(dá)及血漿TNF-α含量升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿TNF-α含量和坐骨神經(jīng)p-p38蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），各給藥組p38蛋白表達(dá)降低，但只有糖痹康高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 糖痹康下調(diào)大鼠坐骨神經(jīng)p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)和血漿TNF-α含量，可能是其糖尿病周圍神經(jīng)病變神經(jīng)保護(hù)及鎮(zhèn)痛作用靶點(diǎn)之一。

關(guān)鍵詞：糖痹康；糖尿病周圍神經(jīng)病變；p38絲裂原活化蛋白激酶；腫瘤壞死因子-α；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.018

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）03-0067-03

Abstract： Objective To explore the effects of Chinese herbal compound Tangbikang on the expressions of p38 MAPK of sciatic nerve and plasma TNF-α in diabetic rats. Methods Ten of the sixty male SD rats were selected randomly as normal group， and the rest were fed with high-fat diet and low-dosage STZ was used to induce type Ⅱ diabetic rat models. Model rats were randomly divided into model group， mecobalamine group and Tangbikang low-， medium-， and high-dosage groups， 10 rats in each group. Each medication group was intervened with relevant medicine. Rat unilaterals sciatic nerves were taken after 16 weeks. The content of TNF-α in plasma was determined by radioimmunoassay. Western blot method was used to detect the expressions of p38 and p-p38 MAPK protein of sciatic nerve. Results Compared with normal group， the expressions of p38 and p-p38 protein and content of TNF-α in model group significantly increase （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the expressions of p-p38 protein and the content of TNF-α significantly decreased after medicine intervention in different doses Tangbikang groups and mecobalamin group （P<0.05， P<0.01）. The expression of p38 protein in Tangbikang high-dose group significantly decreased （P<0.05）， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Tangbikang can reduce the expression of p38 and p-p38 MAPK protein of the rat sciatic nerve， and reduce the content of TNF-α protein in rat plasma， which may be one of the effective targets of neuroprotection and abirritation of diabetic peripheral neuropathy.

Key words： Tangbikang； diabetic peripheral neuropathy； p38 MAPK； TNF-α； rats

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是由糖尿病導(dǎo)致的周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變，特點(diǎn)是由于對(duì)稱的遠(yuǎn)端周圍神經(jīng)組織退化，導(dǎo)致其感覺(jué)的痛苦和缺失。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)2型糖尿病大鼠模型，觀察中藥復(fù)方糖痹康對(duì)模型大鼠坐骨神經(jīng)p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）及血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)及鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（160±10）g。許可證號(hào)SCXK（京）2004-0009，北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%，光照12 h，噪音<60 dB，自由攝食飲水，分籠喂養(yǎng)。

1.2 藥物與飼料

糖痹康由黃芪、女貞子、桂枝、黃芩、黃連等組成，飲片由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供；甲鈷胺片，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司制造，批號(hào)111109A。高脂飼料，北京華阜康生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

TNF-α放射免疫試劑盒（北京華力特生物技術(shù)研究所），p38、p-p38為兔來(lái)源的單克隆抗體（美國(guó)CST公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。硝酸纖維素膜（德國(guó)Millipore），穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)Bio-Rad），電子天平Sartouris（德國(guó)BS224S），紫外分光光度計(jì)eppendorf（德國(guó)Biophotometer）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只為正常組，普通飼料喂養(yǎng)。其余喂高脂飼料，8周后參考文獻(xiàn)[1]造模，予STZ 35 μg/g腹腔內(nèi)注射。72 h后檢測(cè)尾尖血血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L為造模成功。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、甲鈷胺組和糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥

血糖穩(wěn)定3 d后開(kāi)始灌胃給藥。糖痹康低、中、高劑量組分別按成人劑量5、10、20倍給藥，分別為4.175、8.35、16.7 g原藥材/（g·d），均換算成糖痹康為3 mL灌胃；甲鈷胺組按成人劑量10倍給藥，即1.97 mg/（g·d）， 用蒸餾水配成混懸液3 mL灌胃；空白組和模型組給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食飲水，連續(xù)16周。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 腫瘤壞死因子-α含量檢測(cè) 給藥16周后，大鼠10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血2 mL，置于預(yù)冷的含7.5% EDTA 30 μL和抑肽酶40 μL無(wú)菌采血管中混勻，-4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血漿，放入-80 ℃冰箱備用。采用放免法檢測(cè)血漿TNF-α含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.3.2 p38絲裂素活化蛋白激酶蛋白表達(dá)檢測(cè) 給藥16周后，按350 mg/100 g劑量10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取4 cm左右大鼠坐骨神經(jīng)置于凍存管，迅速投入液氮中保存。Western-blot檢測(cè)p38 MAPK蛋白表達(dá)。從液氮中取出部分組織研磨，經(jīng)組織裂解液裂解后上樣電泳，初始電壓80 V，待溴酚藍(lán)染料前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至100 V，直至溴酚藍(lán)泳出分離膠下緣結(jié)束電泳。采用半干電轉(zhuǎn)移儀在PVDF膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，恒流30 mA，持續(xù)90 min。取出PVDF膜用5%TBST脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min。封閉結(jié)束后，用TBS-T漂洗液洗10 min×3次，將膜移入雜交袋中，加用漂洗液稀釋的抗體（p38、p-p38均為1∶1000），封口，4 ℃孵育過(guò)夜；再用TBST漂洗液洗10 min×3次，加漂洗液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（p38、p-p38均為1∶1000），37 ℃振蕩60 min。將PVDF膜置ECL顯色液中于室溫下振蕩溫育5 min，于暗室中曝光、顯影、定影。清水沖洗后，晾干保存，掃描，使用IPP軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 糖痹康對(duì)模型大鼠血漿腫瘤壞死因子-α的影響

與正常組比較，模型組大鼠血漿TNF-α含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿TNF-α含量顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 糖痹康對(duì)模型大鼠坐骨神經(jīng)p38絲裂素活化蛋白激酶表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)p38、p-p38蛋白表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各給藥組p-p38蛋白表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01），各給藥組p38蛋白表達(dá)降低，但只有糖痹康高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

5 討論

糖痹康組方源自黃芪桂枝五物湯（《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》）。既往實(shí)驗(yàn)研究表明，糖痹康可提高STZ誘導(dǎo)的DPN大鼠周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善神經(jīng)病理，提高坐骨神經(jīng)Na+-K+-ATP酶活性和cAMP、cGMP含量，且存在劑量依賴關(guān)系，對(duì)DPN有一定的保護(hù)作用；改善STZ誘導(dǎo)的DPN大鼠脂質(zhì)代謝，升高血清超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶、一氧化氮含量，降低丙二醛含量，減輕氧化應(yīng)激造成的周圍神經(jīng)損害，具有抗氧化應(yīng)激作用，顯著上調(diào)DPN大鼠血漿β-內(nèi)啡肽的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用及鎮(zhèn)痛作用[2-6]。

p38 MAPK是MAPK超家族重要成員之一，與DPN關(guān)系最密切的成員，是目前研究最多的氧化應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。激活后的MAPK可停留在胞質(zhì)中，激活其他蛋白酶，使細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白磷酸化；也可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成和通道改變。DPN患者腓腸神經(jīng)中p38總體水平升高[7]。糖尿病神經(jīng)病理痛是DPN患者最常見(jiàn)、嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的癥狀之一，同時(shí)其發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚。研究表明，p38 MAPK在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中起關(guān)鍵作用[8]，同時(shí)炎性通路的激活是造成DPN的重要途徑之一。TNF-α是一種重要的炎癥因子，與DPN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。越來(lái)越多的資料表明，免疫和炎前介質(zhì)，尤其TNF-α在外周神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及維持中起著重要作用[9]，其與p38 MAPK之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系更成為研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠坐骨神經(jīng)組織p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)和血漿TNF-α含量較正常組顯著升高；糖痹康各劑量組p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)和TNF-α含量較模型組顯著降低。由此，我們推測(cè)糖痹康可下調(diào)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)和血漿TNF-α含量，可能是其DPN神經(jīng)保護(hù)及鎮(zhèn)痛作用靶點(diǎn)之一。

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（收稿日期：2015-04-21）

（修回日期：2015-06-30；編輯：華強(qiáng)）