黃芪、丹參酮ⅡA和5-氟尿嘧啶單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外作用研究

田亞萍，王園園，遲寶榮

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

黃芪、丹參酮ⅡA和5-氟尿嘧啶單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外作用研究

田亞萍，王園園，遲寶榮

目的 檢測(cè)黃芪、丹參酮ⅡA、5-氟尿嘧啶(5-FU)單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用及其抗腫瘤機(jī)制，探討黃芪、丹參酮ⅡA在宮頸癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。方法 2014年3—12月選取人宮頸癌HeLa細(xì)胞,分為6組，包括對(duì)照組、黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組、黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組，每組分別加入不同濃度的藥物進(jìn)行處理。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)氧化應(yīng)激因子丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)活力。結(jié)果 4.0 g/ml黃芪、8.0 μg/ml丹參酮ⅡA、50.0 mg/L 5-FU、4.0 g/ml黃芪+8.0 μg/ml丹參酮ⅡA、4.0 g/ml黃芪+8.0 μg/ml丹參酮ⅡA+50.0 mg/L 5-FU人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05)。培養(yǎng)72 h后，黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組升高(P<0.05)；黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組升高(P<0.05)。黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組升高(P<0.05)。不同組MDA水平及GSH活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同組SOD活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組、黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組SOD活力較對(duì)照組降低(P<0.05)。結(jié)論 黃芪、丹參酮ⅡA、5-FU可誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，聯(lián)用后可增加抗腫瘤活性，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

宮頸腫瘤；黃芪；丹參酮；氟尿嘧啶；HeLa細(xì)胞；體外研究

田亞萍，王園園，遲寶榮.黃芪、丹參酮ⅡA和5-氟尿嘧啶單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外作用研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(9)：1081-1085.[www.chinagp.net]

Tian YP,Wang YY,Chi BR.In vitro effect of astragalus,tanshinoneⅡA,5-fluorouracil alone or their combined use on human cervical carcinoma HeLa cells[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1081-1085.

宮頸癌是引起婦女死亡的主要原因之一。中藥聯(lián)合化療藥物在一定程度上減少化療藥物毒副作用的產(chǎn)生，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者生活質(zhì)量[1]。臨床用于各類中、晚期癌癥患者的扶正固本方劑對(duì)提高患者近期、遠(yuǎn)期療效均有益處[2-3]。黃芪(astragalus)具有健脾補(bǔ)中、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表、利尿等功效，在體內(nèi)和體外均對(duì)各類癌癥具有較好的抑制作用[3]。從丹參中提取的脂溶性單體——丹參酮ⅡA (tanshione ⅡA)有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其分化和凋亡的作用[4-5]。黃芪和丹參酮ⅡA對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用已有研究報(bào)道[6-7]，但二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用及機(jī)制研究尚未見報(bào)道。另外，黃芪丹參復(fù)方注射液具有清除氧自由基、減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體細(xì)胞損傷的作用[8]，此種藥物活性能否保護(hù)腫瘤細(xì)胞未見報(bào)道。因而，本研究于2014年3—12月研究黃芪、丹參酮ⅡA、5-氟尿嘧啶(5-FU)單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用及其抗腫瘤機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 黃芪注射液為正大制藥集團(tuán)產(chǎn)品(每毫升相當(dāng)于生藥黃芪 2 g，批號(hào)1305051)。丹參酮ⅡA為中國(guó)藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)1401026)，溶解于適量的二甲基亞砜(DMSO)，終濃度為0.1%。5-FU購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司(批號(hào)130801)。胎牛血清(GIBCO公司)，RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)，胰蛋白酶(AMRESCO公司)。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，丙二醛(MDA)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 儀器與器材 熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀(Olympus)，5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation)，恒溫培養(yǎng)箱(諾基儀器)，生物安全柜〔力新儀器(上海)有限公司〕，倒置相差顯微鏡(Olympus)，Mode1680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，置于含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組不加入任何藥物；黃芪組：分別加入不同濃度黃芪注射液，含生藥0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 g/ml；丹參酮ⅡA組：分別加入不同濃度丹參酮ⅡA，終濃度0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml；5-FU組：分別加入不同濃度5-FU，終濃度3.5、7.0、12.5、25.0、50.0 mg/L；黃芪+丹參酮ⅡA組：分別加入不同濃度黃芪注射液和丹參酮ⅡA，0.1 g/ml+0.5 μg/ml、0.5 g/ml+1.0 μg/ml、1.0 g/ml+2.0 μg/ml、2.0 g/ml+4.0 μg/ml、4.0 g/ml+8.0 μg/ml；黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組：分別加入不同濃度黃芪注射液、丹參酮ⅡA和5-FU：0.1 g/ml+0.5 μg/ml+3.5 mg/L、0.5 g/ml+1.0 μg/ml+7.0 mg/L、1.0 g/ml+2.0 μg/ml+12.5 mg/L、2.0 g/ml+4.0 μg/ml+25.0 mg/L、4.0 g/ml+8.0 μg/ml+50.0 mg/L。

1.3.3 生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)黃芪、丹參酮ⅡA、5-FU單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。取1×108個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，分別加入200 μl不同濃度、不同組分藥物，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各用藥組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫下振蕩 10 min將結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值(OD 值)。生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 各用藥組細(xì)胞于培養(yǎng)72 h后消化收集，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，70%乙醇固定，4 ℃過夜。PBS洗滌2次RNA酶，消化30 min后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。每組重復(fù)3次。采用CellQuest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 MDA水平及SOD、GSH活力測(cè)定 各組細(xì)胞于培養(yǎng)72 h后消化收集，PBS洗滌2次，收集細(xì)胞于1.5 ml EP 管中，-80 ℃超低溫冰箱凍存待檢。每份細(xì)胞樣本加入0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液，超聲波破碎,3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)。收集上清液。按照試劑盒說明書分別檢測(cè)MDA水平及SOD、GSH活力。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芪組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，不同濃度黃芪組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中4.0 g/ml黃芪人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05,見表1)。

2.2 不同濃度丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，不同濃度丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中8.0 μg/ml丹參酮ⅡA人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05，見表2)。

2.3 不同濃度5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，不同濃度5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中50.0 mg/L 5-FU人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05，見表3)。

2.4 不同濃度黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，不同濃度黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中4.0 g/ml黃芪+8.0 μg/ml丹參酮ⅡA人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05，見表4)。

2.5 不同濃度黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，不同濃度黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中4.0 g/ml黃芪+8.0 μg/ml丹參酮ⅡA+50.0 mg/L 5-FU人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高，同組培養(yǎng)72 h后人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率最高(P<0.05，見表5)。

2.6 不同用藥組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 培養(yǎng)72 h后，選取各用藥組最高濃度組進(jìn)行比較，不同用藥組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表6)。

Table 1 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rate in astragalus group among different drug concentrations

黃芪(g/ml)24h48h72hF值P值01365±045987±087e1723±168ef11000<000105534±042a1564±144ae2427±327aef6246<0001101769±205ab2579±198abe3175±522abef12670007201936±278abc3142±403abce3937±377abcef23930001402864±196abcd4723±339abcde5545±493abcdef4283<0001F值1009092184111P值<0001<0001<0001

注：與0.1 g/ml黃芪比較，aP<0.05；與0.5 g/ml黃芪比較，bP<0.05；與1.0 g/ml黃芪比較，cP<0.05；與2.0 g/ml黃芪比較，dP<0.05；與同組培養(yǎng)24 h后比較，eP<0.05；與同組培養(yǎng)48 h后比較，fP<0.05

2.7 不同用藥組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)72 h后，選取各用藥組最高濃度組進(jìn)行比較，不同用藥組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率較黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表7)。

2.8 不同組MDA水平及SOD、GSH活力比較 培養(yǎng)72 h后，選取各組最高濃度組進(jìn)行比較，不同組MDA水平及GSH活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同組SOD活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組、黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組SOD活力較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表8)。

Table 2 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rate in tanshinone ⅡA group among different drug concentrations

丹參酮ⅡA(μg/ml)24h48h72hF值P值05459±0521285±187e1723±222ef4264<000110792±064a2528±311ae3764±421aef7215<0001201524±138ab3104±369abe4396±594abef3665<0001402035±153abc4666±582abce5537±674abcef3664<0001803004±300abcd5642±581abcde5953±688abcdef26230001F值1108047432786P值<0001<0001<0001

注：與0.5 μg/ml丹參酮ⅡA比較，aP<0.05；與1.0 μg/ml丹參酮ⅡA比較，bP<0.05；與2.0 μg/ml丹參酮ⅡA比較，cP<0.05；與4.0 μg/ml丹參酮ⅡA比較，dP<0.05；與同組培養(yǎng)24 h后比較，eP<0.05；與同組培養(yǎng)48 h后比較，fP<0.05

Table 3 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rate in 5-FU group among different drug concentrations

5?FU(mg/L)24h48h72hF值P值35457±0671184±296e1516±245ef1736000370741±065a1864±233ae2945±498aef3566<00011251609±211ab2374±198abe3098±451abef173800032502066±185abc2549±365abce3647±410abcef176100035002946±365abcd4283±458abcde5689±687abcdef20780002F值691038082979P值<0001<0001<0001

注：5-FU=5-氟尿嘧啶；與3.5 mg/L 5-FU比較，aP<0.05；與7.0 mg/L 5-FU比較，bP<0.05；與12.5 mg/L 5-FU比較，cP<0.05；與25.0 mg/L 5-FU比較，dP<0.05；與同組培養(yǎng)24 h后比較，eP<0.05；與同組培養(yǎng)48 h后比較，fP<0.05

表4 不同濃度黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較±s，%，n=3)

注：與0.1 g/ml黃芪+0.5 μg/ml丹參酮ⅡA比較，aP<0.05；與0.5 g/ml黃芪+1.0 μg/ml丹參酮ⅡA比較，bP<0.05；與1.0 g/ml黃芪+2.0 μg/ml丹參酮ⅡA組比較，cP<0.05；與2.0 g/ml黃芪+4.0 μg/ml丹參酮ⅡA比較，dP<0.05；與同組培養(yǎng)24 h后比較，eP<0.05；與同組培養(yǎng)48 h后比較，fP<0.05

Table 5 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rate in astragalus+tanshinone ⅡA+5-FU group among different drug concentrations

黃芪+丹參酮ⅡA+5?FU24h48h72hF值P值01g/ml+05μg/ml+35mg/L735±0851467±165e1868±225ef3492<000105g/ml+10μg/ml+70mg/L534±058a2558±384ae4629±598aef7421<000110g/ml+20μg/ml+125mg/L1769±421ab3587±425abe5735±765abef3761<000120g/ml+40μg/ml+250mg/L2836±365abc4267±566abce6558±829abcef2781<000140g/ml+80μg/ml+500mg/L4164±596abcd6743±955abcde8285±1055abcdef16390004F值509337513066P值<0001<0001<0001

注：與0.1 g/ml黃芪+0.5 μg/ml丹參酮ⅡA+3.5 mg/L 5-FU比較，aP<0.05；與0.5 g/ml黃芪+1.0 μg/ml丹參酮ⅡA+7.0 mg/L 5-FU比較，bP<0.05；與1.0 g/ml黃芪+2.0 μg/ml丹參酮ⅡA+12.5 mg/L 5-FU比較，cP<0.05；與2.0 g/ml黃芪+4.0 μg/ml丹參酮ⅡA+25.0 mg/L 5-FU比較，dP<0.05；與同組培養(yǎng)24 h后比較，eP<0.05；與同組培養(yǎng)48 h后比較，fP<0.05

3 討論

臨床上，黃芪常被單獨(dú)或組成方劑用于各種中、晚期腫瘤患者的治療，如十全大補(bǔ)湯、補(bǔ)中益氣湯等[6]。黃芪具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗病毒等作用，同時(shí)具有保護(hù)心肌、肝臟等重要臟器的作用，是新藥及食品保健研究的熱點(diǎn)之一[9-10]。丹參酮ⅡA是一種低毒、抗瘤譜廣的中藥單體，已證實(shí)其對(duì)多種腫瘤具有殺傷作用[4]。黃芪與丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用治療宮頸癌療效是否優(yōu)于單藥以及其作用機(jī)制的研究，對(duì)治療宮頸癌和黃芪與丹參酮ⅡA的進(jìn)一步開發(fā)利用具有十分重要的價(jià)值。

Table 6 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rate among different drug groups

組別生長(zhǎng)抑制率黃芪組5545±493丹參酮ⅡA組5953±6885?FU組5689±687黃芪+丹參酮ⅡA組6647±666abc黃芪+丹參酮ⅡA+5?FU組8285±1055abcdF值690P值0006

注：與黃芪組比較，aP<0.05；與丹參酮ⅡA組比較，bP<0.05；與5-FU組比較，cP<0.05；與黃芪+丹參酮ⅡA組比較，dP<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、丹參酮ⅡA對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且黃芪+丹參酮ⅡA組人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率高于黃芪組、丹參酮ⅡA、5-FU組，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率高于黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組及黃芪+丹參酮ⅡA組。表明黃芪、丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用在抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖方面效果優(yōu)于兩藥單用，除本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用外，還能對(duì)化療藥物有增敏作用[11]。

Table 7 Comparison of human cervical carcinoma HeLa cell apoptosis rate among different drug groups

組別細(xì)胞凋亡率黃芪組4674±334丹參酮ⅡA組5459±6655?FU組4907±536黃芪+丹參酮ⅡA組5584±485黃芪+丹參酮ⅡA+5?FU組6592±888abcdF值446P值0025

注：與黃芪組比較，aP<0.05；與丹參酮ⅡA組比較，bP<0.05；與5-FU組比較，cP<0.05；與黃芪+丹參酮ⅡA組比較，dP<0.05

Table 8 Comparison of MDA level and the activity of SOD and GSH among different groups

組別MDA(nmol/ml)SOD(nU/mg)GSH(nU/mg)對(duì)照組055±0153132±055132±104黃芪組059±0142817±040a124±161丹參酮ⅡA組060±0132870±177a1269±1555?FU組067±0092716±058a1189±127黃芪+丹參酮ⅡA組069±0152651±075a1044±161黃芪+丹參酮ⅡA+5?FU組074±0112563±111a1001±017F值0911260285P值0508<00010064

注：MDA=丙二醛, SOD=超氧化物歧化酶，GSH=谷胱甘肽；與對(duì)照組比較，aP<0.05

許多誘導(dǎo)劑能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其分化，作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)胞原癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期及DNA合成[12]。本研究提示，黃芪、丹參酮ⅡA、5-FU聯(lián)合應(yīng)用于人宮頸癌HeLa 細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用顯著提高，與前期研究結(jié)果一致[13]。

SOD在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用[14]，SOD亦可通過多種途徑激活自噬[15]。生理情況下，SOD的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，如果SOD產(chǎn)生超過了清除的能力，就會(huì)破壞生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生過量的MDA，損傷細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能[16]。黃芪和丹參酮ⅡA能夠保護(hù)機(jī)體細(xì)胞減輕氧化應(yīng)激損傷，本研究結(jié)果表明，黃芪組、丹參酮ⅡA組、5-FU組、黃芪+丹參酮ⅡA組、黃芪+丹參酮ⅡA+5-FU組SOD活力較對(duì)照組降低，加劇活性氧對(duì)腫瘤細(xì)胞的破壞，但該作用與時(shí)間、藥物濃度的關(guān)系仍需要深入探索。

黃芪和丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，藥理作用機(jī)制明確，不良反應(yīng)小，二者聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的治療和作為輔助化療藥物國(guó)內(nèi)外迄今還未見報(bào)道，本研究為二者聯(lián)合治療腫瘤的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：田亞萍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；田亞萍、王園園進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；遲寶榮進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]Owrangi AM,Prisciandaro JI,Soliman A,et al.Magnetic resonance imaging-guided brachytherapy for cervical cancer:initiating a program[J].J Contemp Brachytherapy,2015,7(5):417-422.

[2]Wang X,Feng Y,Wang N,et al.Chinese medicines induce cell death:the molecular and cellular mechanisms for cancer therapy[J].Biomed Res Int,2014,2014:530342.

[3]Hu B,Wang SS,Du Q.Traditional Chinese medicine for prevention and treatment of hepatocarcinoma:from bench to bedside[J].World J Hepatol,2015,7(9):1209-1232.

[4]Zhang Y,Jiang P,Ye M,et al.Tanshinones:sources,pharmacokinetics and anti-cancer activities[J].Int J Mol Sci,2012,13(10):13621-13666.

[5]王茂林,陳世益,李云霞,等.黃芪皂甙和丹參酮ⅡA注射液對(duì)大鼠骨骼肌鈍挫傷后氧化應(yīng)激的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2011,30(2):162-165.

[6]李敏州,高彥彬.自擬黃芪生脈散治療糖尿病冠心病29例臨床觀察[J].疑難病雜志,2010,09(9):676-678.

[7] 沈雋,王照艷,張曉，等.丹參酮ⅡA對(duì)HeLa宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)藥房,2007,18(27):2012-2014.

[8]Geng LM,Han FQ,Tian JB,et al.Effects of the combination of Danshen injection and Huangqi injection on the cardic patients′hemorheology and ejection fraction[J].Chinese General Practice，2004,7(7):455,458.(in Chinese) 耿立梅,韓鳳芹,田金彪，等.丹參液與黃芪液合用對(duì)冠心病患者血液流變學(xué)及射血分?jǐn)?shù)的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2004,7(7):455,458.

[9]王曉莉,蘇志紅,李妍芹,等.黃芪對(duì)體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(4):270-272.

[10]Shan GZ,Ye XT.Clinical observation of astraglaus polysaccharide combined with chemotherapy in 84 cases of patients with advanced cancer[J].Chinese Journal of Clinical Oncology,2007,34(6):355-356.(in Chinese) 山廣志,葉興濤.注射用黃芪多糖聯(lián)合化療治療84例晚期惡性腫瘤臨床療效觀察[J].中國(guó)腫瘤臨床,2007,34(6):355-356.

[11]王冬，田亞平，姜英雁，等.丹參酮ⅡA抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(6):676-678.

[12]Fuhrman CB,Kilgore J,LaCoursiere YD,et al.Radiosensitization of cervical cancer cells via double-strand DNA break repair inhibition[J].Gynecol Oncol,2008,110(1):93-98.

[13]王冬,田亞平,姜英雁，等.丹參酮ⅡA與5-FU抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(22):3237-3240.

[14]Guha P,Dey A,Sen R,et al.Intracellular GSH depletion triggered mitochondrial Bax translocation to accomplish resveratrol-induced apoptosis in the U937 cell line[J].J Pharmacol Exp Then,2011,336(1):206-214.

[15] 紀(jì)元,龍建綱,劉健康.自噬發(fā)生中的ROS調(diào)節(jié)機(jī)制[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2014,30(4):321-327.

[16] 李宏林，王煒，杜英.自擬活血通脈靈對(duì)心肌缺血大鼠SOD活性和MDA含量的影響[J]，疑難病雜志，2012，11(4)：277.

(本文編輯：陳素芳)

In Vitro Effect of Astragalus,TanshinoneⅡA,5-fluorouracil Alone or Their Combined Use on Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

TIANYa-ping,WANGYuan-yuan,CHIBao-rong.DepartmentofDermatologyandVenereology,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China

Objective To investigate the inhibitory effect and anti-tumor mechanism of astragalus,tanshinoneⅡ A,and 5-fluorouracil(5-FU) used alone or in combination on human cervical carcinoma cells,and to explore the application value of astragalus injection and tanshinoneⅡA in cervical cancer treatment.Methods Human cervical carcinoma HeLa cells were sampled and divided into six groups:control group,astragalus group (group 1),tanshinone ⅡA group (group 2),5-FU group(group 3),astragalus+tanshinoneⅡA group(group 4),astragalus+tanshinone ⅡA+5-FU group(group 5) from March to December in 2014.Each group was administrated with different concentrations of drugs.MTT method and FCM method were used to detect the HeLa cell growth inhibition rate and cell apoptosis rate of human cervical carcinoma and detect MDA level and the activity of SOD and GSH.Results Group 1,group 2,group 3,group 4 and group 5 had the highest human cervical carcinoma HeLa cell growth inhibition rates when drug concentration was 4.0 g/ml，8.0 μg/ml，50.0 mg/L，4.0 g/ml +8.0 μg/ml，4.0 g/ml +8.0 μg/ml+50.0 mg/L(P<0.05);the 5 groups had highest HeLa cell growth inhibition rates after 72 h culture(P<0.05).After 72 h culture,group 4 was higher than group 1,group 2 and group 3 in HeLa cell growth inhibition rate(P<0.05);group 5 was higher than group 1,group 2 and group 3 and group 4 in HeLa cell growth inhibition rate (P<0.05).Group 5 was higher than group 1,group 2 and group 3 and group 4 in HeLa cell apoptosis rate (P<0.05).No significant differences existed in MDA level and GSH activity among different groups (P>0.05)；significant differences existed in SOD activity among different groups (P<0.05);group 1,group 2,group 3,group 4 and group 5 were lower than control group in SOD activity (P<0.05).Conclusion Astragalus injection solution,tanshinoneⅡA and 5-FU can induce the apoptosis of human cervical cancer HeLa cells,and their combined use can increase antitumor activity,and have clinical application value.

Uterine cervical neoplasms；Astragalus membranaceus；Tanshinone；Fluorouracil；HeLa cells；In vitro

吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2012-130)

130021 吉林省長(zhǎng)春市，吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科(田亞萍，王園園)，消化內(nèi)科(遲寶榮)

遲寶榮，130021 吉林省長(zhǎng)春市，吉林大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科；E-mail:chibr@jlu.edu.cn

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.020

2015-05-24；

2016-01-10)