Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉玉峰，耿召華，牛麗麗

·論著·

Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉玉峰，耿召華，牛麗麗

目的 探討小G蛋白Rad對心肌營養(yǎng)素1(CT-1)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的影響。方法 2011年6月—2013年3月，選取新生健康雄性SD乳鼠60只。構(gòu)建載有Rad基因的腺病毒載體(Ad-Rad)、含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體(Ad-GFP)。取乳鼠心臟并剪碎，進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將提取的原代心肌細(xì)胞平均分為6組，即空白對照組〔轉(zhuǎn)染磷酸鹽緩沖液(PBS)，刺激物為PBS〕、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為PBS)、Ad-Rad組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為PBS)、CT-1對照組(轉(zhuǎn)染PBS，刺激物為CT-1)、Ad-GFP+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為CT-1)、Ad-Rad+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為CT-1)。轉(zhuǎn)染腺病毒載體48 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率，并采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測Rad、心房鈉因子(ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)水平，Western blotting法檢測Rad表達(dá)水平。結(jié)果 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%。Ad-Rad組Rad mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。Ad-Rad組Rad表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組(P<0.05)。結(jié)論 Rad具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。

肥大；肌細(xì)胞,心臟；Rad；心肌營養(yǎng)素1；腺病毒

劉玉峰，耿召華，牛麗麗.Rad對心肌營養(yǎng)素1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(9)：1032-1036.[www.chinagp.net]

Liu YF,Geng ZH,Niu LL.Effect of Rad on myocardial cells hypertrophy induced by cardiotrophin-1[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1032-1036.

Rad(Ras associated with diabetes)是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，屬于RGK亞家族成員之一[1-2]。在心血管疾病中，小G蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能、血管平滑肌細(xì)胞的收縮、增殖、遷移以及心肌細(xì)胞肥大與凋亡的發(fā)生均具有調(diào)節(jié)作用[3]。Chang等[4]首次報道，小G蛋白Rad缺乏易導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。但是Rad是否具有負(fù)性調(diào)節(jié)心肌營養(yǎng)素1(cardiotrophin-1，CT-1)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的研究國內(nèi)外鮮見報道，故本研究以CT-1作為促心肌細(xì)胞肥大刺激因子，以心房鈉因子(atrialnatriuretic factor，ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)水平作為心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)，研究Rad過表達(dá)對心肌細(xì)胞肥大過程中細(xì)胞內(nèi)ANF、β-MHC mRNA表達(dá)水平的影響，以探討Rad是否具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2011年6月—2013年3月，選取新生健康雄性SD乳鼠60只，體質(zhì)量約20 g，鼠齡1～2 d，由第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號：SYXK-軍2012-0011)。

1.2 主要試劑及設(shè)備 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)，CT-1(Gibico公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(Takara公司)，Rad抗體(Santa Cruz公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI 7500)。

1.3 研究方法

1.3.1 構(gòu)建缺陷腺病毒載體 構(gòu)建載有Rad基因的腺病毒載體(Ad-Rad)、含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體(Ad-GFP)。

1.3.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 取出新生SD乳鼠心臟并剪碎，采取分步消化法提取心肌細(xì)胞懸液，純化心肌細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置入CO2

本研究背景：

Rad是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，其生物學(xué)功能非常廣泛，包括參與細(xì)胞增殖、遷移，細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)以及腫瘤癌基因的調(diào)節(jié)等。人類Rad基因在心血管系統(tǒng)的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，在骨骼肌、心臟和肺臟中表達(dá)水平較高。研究報道，小G蛋白Rad功能缺乏易導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，提示Rad可能參與心肌細(xì)胞肥大的進(jìn)展。

培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及其處理方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將提取的原代心肌細(xì)胞平均分為6組，即空白對照組〔轉(zhuǎn)染磷酸鹽緩沖液(PBS)，刺激物為PBS〕、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為PBS)、Ad-Rad組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為PBS)、CT-1對照組(轉(zhuǎn)染PBS，刺激物為CT-1)、Ad-GFP+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-GFP，刺激物為CT-1)、Ad-Rad+CT-1組(轉(zhuǎn)染Ad-Rad，刺激物為CT-1)。轉(zhuǎn)染腺病毒載體48 h后，熒光顯微鏡下觀察，用PBS清洗3遍，加入不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，饑餓心肌細(xì)胞24 h，各組分別加入刺激物，培養(yǎng)48 h，PBS清洗3遍，裂解細(xì)胞并收集裂解細(xì)胞液。

1.3.4 檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率 調(diào)整感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20，分別轉(zhuǎn)染Ad-GFP、Ad-Rad腺病毒，48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并采用流式細(xì)胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率。1.3.5 RT-PCR法檢測Rad、ANF、β-MHC mRNA表達(dá)水平 按RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，設(shè)計Rad、ANF、β-MHC mRNA的引物：Rad上游引物為5′-CGCATCTTTGGTGGAGTAGAA-3′，下游引物為5′-GCCCTTGTCCGTTATTGAGTA-3′，產(chǎn)物長度為201 bp；ANF上游引物為5′-AGGAGAAGATGCCGGTAGAG-3′，下游引物為5′-AGAGCCCTCAGTTTGCTTTCTT-3′，產(chǎn)物長度為211 bp；β-MHC上游引物為5′-TCCAGAAGAGAAGAACTCCATTT-3′，下游引物為5′-ATACTCGTTGCCCACTTTGACTAAT-3′，產(chǎn)物長度為205 bp。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，其上游引物為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACT-3′，產(chǎn)物長度為252 bp。采用實(shí)時熒光定量PCR儀計算基因相對表達(dá)水平，空白對照組mRNA表達(dá)水平設(shè)定為1。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。1.3.6 Western blotting法檢測Rad表達(dá)水平 裂解各組心肌細(xì)胞，提取總蛋白，調(diào)整蛋白上樣量，使各組蛋白上樣量相等，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%胎牛血清清蛋白封閉1 h，用Rad一抗與聚偏二氟乙烯膜結(jié)合孵育過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的Rad二抗結(jié)合，室溫孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯像。采用ODYSSEY 13.0掃描儀對膠片掃描成像，用Quantity One軟件對圖像進(jìn)行吸光度分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶信號強(qiáng)度比值代表心肌細(xì)胞中Rad表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率 腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%(見圖1～3，本文圖1、2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

圖1 倒置顯微鏡下心肌細(xì)胞(×100)

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

以腺病毒為目的基因的載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，心肌營養(yǎng)素1(CT-1)作為促心肌細(xì)胞肥大刺激因子，心房鈉因子(ANF)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)水平作為心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)，研究Rad過表達(dá)對心肌細(xì)胞肥大過程中細(xì)胞內(nèi)ANF、β-MHC mRNA表達(dá)水平的影響，以探討Rad是否具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。為探索Rad負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制提供重要線索，從而為心肌肥厚在臨床治療方面的研究提供了新的策略。

圖2 熒光顯微鏡下心肌細(xì)胞(×100)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測腺病毒載體轉(zhuǎn)染率結(jié)果

2.2 各組Rad、ANF、β-MHC mRNA表達(dá)水平比較 各組Rad mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ad-Rad組Rad mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組Rad mRNA表達(dá)水平低于Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

各組ANF mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

各組β-MHC mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC among each group

組別RadmRNAANFmRNAβ?MHCmRNA空白對照組100±000100±000100±000Ad?GFP組098±005100±006096±019Ad?Rad組330±015ab107±008080±009CT?1對照組100±002c140±010abc246±020abcAd?GFP+CT?1組103±005c138±004abc204±016abcAd?Rad+CT?1組327±015abde085±003abcde080±004deF值5022903879337086P值<0001<0001<0001

注：Ad-GFP=含有編碼綠色熒光蛋白基因的空白腺病毒載體，Ad-Rad=載有Rad基因的腺病毒載體，CT-1=心肌營養(yǎng)素1，ANF=心房鈉因子，β-MHC=β肌球蛋白重鏈；與空白對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP組比較，bP<0.05；與Ad-Rad組比較，cP<0.05；與CT-1對照組比較，dP<0.05；與Ad-GFP+CT-1組比較，eP<0.05

2.3 各組Rad表達(dá)水平比較 各組Rad表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Ad-Rad組Rad表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組Rad表達(dá)水平低于Ad-Rad組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1組Rad表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 各組Rad表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP組比較，bP<0.05；與Ad-Rad組比較，cP<0.05；與CT-1對照組比較，dP<0.05；與Ad-GFP+CT-1組比較，eP<0.05

3 討論

Rad是新近發(fā)現(xiàn)的小G蛋白，是Maguire等[5]通過消減克隆方法在2型糖尿病患者的骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，屬于RGK亞家族成員之一，該家族成員還包括Gem/kir、Rem、Rem2。人類Rad基因位于16號染色體q12[2]。Rad分子量為33～35 KDa[5-6]。小G蛋白家族均擁有一個共同的酶域，含170個氨基酸殘基，5個保守氨基酸序列，參與酶的結(jié)構(gòu)域與三磷酸核苷的識別、結(jié)合、水解、分離作用[7]。Rad的生物學(xué)功能非常廣泛，包括參與細(xì)胞增殖、遷移，細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)以及腫瘤癌基因的調(diào)節(jié)等[8-10]。人類Rad基因在心血管系統(tǒng)的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，在骨骼肌、心臟和肺中表達(dá)水平較高[1-2,10]，這提示Rad可能參與心血管疾病的進(jìn)展過程。Chang等[4]首次報道，小G蛋白Rad功能缺乏易導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。然而，小G蛋白Rad是否具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大作用的研究尚未見報道。CT-1最初是從心臟分離出的細(xì)胞因子，在心肌細(xì)胞凋亡、肥大中發(fā)揮重要作用，在體外可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[11]。本研究利用腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)Rad基因，以CT-1作為促心肌細(xì)胞肥大刺激因子，以ANF、β-MHC mRNA表達(dá)水平作為心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)，結(jié)果顯示，腺病毒載體轉(zhuǎn)染率為95.51%，提示心肌細(xì)胞雖然為終末分化細(xì)胞，但通過同源重組構(gòu)建攜帶Rad目的基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，可以高效地將目的基因Rad導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Ad-Rad組Rad mRNA及其蛋白表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組，Ad-Rad+CT-1組Rad mRNA及其蛋白表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，Ad-Rad+CT-1組ANF mRNA表達(dá)水平低于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組、CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組；CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平高于空白對照組、Ad-GFP組、Ad-Rad組，Ad-Rad+CT-1組β-MHC mRNA表達(dá)水平低于CT-1對照組、Ad-GFP+CT-1組。表明Rad過表達(dá)對CT-1所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有抑制作用，提示Rad具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。

目前，對Rad負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示，Rad作為一種新型的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，其與L-型鈣通道β亞單位相結(jié)合，調(diào)節(jié)電壓依賴型L-型鈣通道功能，調(diào)節(jié)心臟興奮收縮偶聯(lián)、腎上腺素受體信號傳導(dǎo)通路和抑制心律失常[2-3,12]。Chang等[4]利用腎上腺素刺激培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，缺失Rad功能的心肌細(xì)胞在腎上腺素刺激下，更容易發(fā)生心肌細(xì)胞肥大，這表明Rad是一種新型的調(diào)節(jié)因子，其可能是通過激活(磷酸化)的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)途徑負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的。這些研究為探索Rad負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制提供重要線索，從而為心肌肥厚在臨床治療方面的研究提供了新的策略。然而其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究并未檢測肥大基因ANF、β-MHC表達(dá)水平，可能對結(jié)果有一定影響，今后將進(jìn)一步完善。

綜上所述，Rad具有負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用。本研究結(jié)論為探索Rad負(fù)性調(diào)節(jié)CT-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制提供了重要線索，從而為心肌肥厚臨床治療方面的研究提供了新的策略。

作者貢獻(xiàn)：劉玉峰進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；耿召華、牛麗麗教授指導(dǎo)標(biāo)書及論文的書寫，并對文章質(zhì)量進(jìn)行控制及審效。

本文無利益沖突。

[1]Bhattacharya M,Babwah AV,Ferguson SS.Small GTP-binding protein-coupled receptors[J].Biochem Soc Trans,2004,32(Pt 6):1040-1044.

[2]Correll RN,Pang C,Niedowicz DM,et al.The RGK family of GTP-binding proteins:regulators of voltage-dependent calcium channels and cytoskeleton remodeling[J].Cell Signal,2008,20(2):292-300.

[3]Zhang J,Chang L,Chen C,et al.Rad GTPase inhibits cardiac fibrosis throughconnective tissue growth factor[J].Cardiovasc Res,2011,91(1):90-98.

[4]Chang L,Zhang J,Tseng YH,et al.Rad GTPase deficiency leads to cardiac hypertrophy[J].Circulation,2007,116(25):2976-2983.

[5]Maguire J,Santoro T,Jensen P,et al.Gem:an induced,immediate early protein belonging to the Ras family[J].Science,1994,265(5169):241-244.

[6]Reynet C,Kahn CR.Rad:a member of the Ras family overexpressed in muscle of type Ⅱ diabetic humans[J].Science,1993,262(5138):1441-1444.

[7]Yanuar A,Sakurai S,Kitano K,et al.Crystal structure of human Rad GTPase of the RGK-family[J].Genes Cells,2006,11(8)：961-968.

[8]Wang Y,Li G,Mao F,et al.Ras-induced epigenetic inactivation of RRAD (Ras-related associated with diabetes) gene promotes glucose uptake in a human ovarian cancer model[J].J Biol Chem,2014,289(20):14225-14238.

[9]Shang R,Wang J,Sun W,et al.RRAD inhibits aerobic glycolysis,invasion,and migration and is associated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol,2015.[Epub ahead of print].

[10]Liao WL,Tan MW,Yuan Y,et al.Brahma-related gene 1 inhibits proliferation and migration of human aortic smooth muscle cells by directly up-regulating Ras-related associated with diabetes in the pathophysiologic processes of aortic dissection[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2015,150(5):1292-1301.

[11]Jiménez-González M,Jaques F,Rodríguez S,et al.Cardiotrophin1 protects beta cells from apoptosis and prevents streptozotocin-induced diabetes in a mouse model[J].Diabetologia,2013,56(4):838-846.

[12]Wang G,Zhu X,Xie W,et al.Rad as a novel regulator of excitation-contraction coupling and beta-adrenergic signaling in heart[J].Circ Res,2010,106(2):317-327.

(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Rad on Myocardial Cells Hypertrophy Induced by Cardiotrophin-1

LIUYu-feng,GENGZhao-hua,NIULi-li.DepartmentofCardiology,JiaxingFirstHospital,theFirstAffiliatedHospitalofJiaxingUniversity,Jiaxing314000,China

Objective To explore the effects of small G-protein Rad on cardiotrophin-1(CT-1)induced myocardial cells hypertrophy.Methods From June 2011 to March 2013,we selected 60 newborn healthy male SD rats.Ad-Radwith Rad genes and Ad-GFP containing gene encoding green fluorescent protein were made.Hearts were taken out from rats and were cut into pieces to conduct myocardial cell primary culture.Using random number table method,we divided the primary myocardial cells into 6 groups:blank control group〔transfection by phosphatebuffer solution(PBS) with PBS as irritant〕,Ad-GFP group(transfection by Ad-GFP with PBS as irritant),Ad-Rad group (transfection by Ad-Rad with PBS as irritant),CT-1 control group (transfection by PBS with CT-1 as irritant),Ad-GFP+CT-1 group (transfection by Ad-GFP with CT-1 as irritant) and Ad-Rad+CT-1group (transfection by Ad-Rad with CT-1as irritant).After adenovirus vector transfection for 48 hours,we detected transfection rate of adenovirus vector by flow cytometry,detected the mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC by RT-PCR method and measured Rad expression by Western blotting method.Results The transfection rate of adenovirus vector was 95.51%.The expression level of Rad mRNA in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of ANF mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of ANF mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in control group,Ad-GFP group,Ad-Rad group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of β-MHC mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of β-MHC mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of Rad in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).Conclusion Rad down-regulates the hypertrophic response of myocardial cells induced by CT-1.

Hypertrophy;Myocytes,cardiac;Rad;Cardiotrophin-1;Adenoviruses

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070093)；重慶市科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(CSTC，2011AC5031)

314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院 嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科(劉玉峰)；第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(耿召華)；北京軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科(牛麗麗)

耿召華，400037重慶市，第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科；E-mail：gengzhh@tom.com

R 542.2 R 364.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.010

2015-05-30；

2016-01-05)