基于IGS和Histone 基因的我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性分析

吳丹妮, 趙志慧, 王艷紅, 周 揚(yáng), 姚毅恒, 陸 俊， 呂國忠

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院, 遼寧大連 116600)

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基于IGS和Histone 基因的我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性分析

吳丹妮, 趙志慧*, 王艷紅, 周 揚(yáng), 姚毅恒, 陸 俊， 呂國忠

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院, 遼寧大連 116600)

摘要[目的]研究我國芒果鐮孢菌的遺傳多樣性。[方法]從云南、廣西、海南等芒果主產(chǎn)區(qū)芒果花序上分離得到芒果鐮孢菌，采用IGS、Histone 2個(gè)基因片段對(duì)芒果鐮孢菌進(jìn)行遺傳多樣性分析。[結(jié)果]我國芒果鐮孢菌具有多個(gè)譜系，致病芒果鐮孢菌為單系群。[結(jié)論] 我國芒果鐮孢菌具有較高的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞芒果；花序畸形??；芒果鐮孢菌

Genetic Diversity ofFusariummangiferaein China Inferred from IGS and Histone

WU Dan-ni, ZHAO Zhi-hui*,WANG Yan-hong et al (College of Environmental and Resource Science, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600)

Abstract[Objective] To study genetic diversity ofFusariummangiferaein China. [Method] Genetic diversity amongF.mangiferaefrom Hainan, Guangxi and Yunnan provinces using the partial IGS and Histone gene sequences were analyzed. The strains were isolated from symptomatic and non-symptomatic inflorescences and twigs. [Result]It was indicated that high genetic variation existed among those strains in China, while the pathogenetic isolates were monophyletic. [Conclusion]Fusariummangiferaein China has high genetic diversity.

Key wordMango; Mango malformation;Fusariummangiferae

芒果花序畸形病(Mango malformation disease, MMD)已成為目前芒果生產(chǎn)上的主要病害之一[1]，在世界上主要芒果產(chǎn)區(qū)如菲律賓、馬來西亞、南美的墨西哥等一些國家均有發(fā)生[2-3]，并不斷蔓延。一旦發(fā)生芒果花序畸形病，芒果樹不能正常開花結(jié)果，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

Watt等[4]于1891年首次發(fā)現(xiàn)芒果花序畸形病，通過柯赫氏法則證明該病是由鐮孢菌FusariummoniliformeSheldon var.subglutinansWollenweber & Reinking引起的[5]，根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果將該病原菌正式定名為芒果鐮孢菌F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[6]。到目前為止，已報(bào)道引起芒果花序畸形病的病原鐮孢菌除芒果鐮孢菌外，還有3種：F.mexicanumT. Aoki, S. Freeman, Otero-Colina, Rodríguez-Alvarado, Fernández-Pavía, Ploetz et O’Donnell，F(xiàn).sterilihyphosumBritz, Marasas & Wingfield，F(xiàn).pseudocircinatumO'Donnell & Nirenberg[7-8]。2008 年8 月在四川攀枝花和云南華坪首次發(fā)現(xiàn)了芒果畸形病[1]，經(jīng)鑒定該病原菌為F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[9]。該病主要發(fā)生在我國金沙江干熱河谷地區(qū)且日趨嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)30%～60%，有的甚至高達(dá)95%[10]。筆者對(duì)廣西、海南、云南等地芒果花序上的芒果鐮孢菌進(jìn)行研究，采用IGS和Histone 2個(gè)基因片段分析芒果鐮孢菌的遺傳多樣性，從而研究芒果鐮孢菌在我國的發(fā)生分布情況。

1材料與方法

1.1材料供試30株鐮孢菌來自廣東省、海南省、廣西壯族自治區(qū)3省區(qū)開花期芒果花序(表1)。采用組織分離法在PDA培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)菌株，采用單孢分離法獲得純培養(yǎng)，在SNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存，保藏于大連民族大學(xué)真菌資源與利用實(shí)驗(yàn)室。

表1　供試菌株及來源

1.2DNA提取及PCR擴(kuò)增DNA提取方法參照Lee等[11]方法。IGS區(qū)采用擴(kuò)增引物NL11、CNS1及中間引物NLa、CNSa進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序[12]，退火溫度58 ℃。Histone片段采用引物H3-1a和H3-1-b進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序[13]。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3系統(tǒng)發(fā)育分析用軟件ClustalX進(jìn)行比對(duì)，手動(dòng)調(diào)整。采用軟件MEGA6.0，以F.saccahari(NRRL13999)為外群，分別構(gòu)建基于IGS和Histone的最小進(jìn)化樹，Bootstrap 1000 replicates； seed=64238。

2結(jié)果與分析

2.1Histone基因片段分析采用引物H3-1a和H3-1b對(duì)來自芒果花序的30株鐮孢菌Histone H3區(qū)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約447 bp的基因片段。以甘蔗鐮孢菌F.sacchari菌株NRRL13999為外群，采用MEGA 6.0構(gòu)建最小進(jìn)化樹(圖1)，對(duì)芒果花序畸形病菌進(jìn)行分析。F.mangiferae形成3個(gè)譜系：I、II、III。譜系I包括菌株19、18、34、15、33、30、14、29、32、16、23、17、5(bootstrap=63%)；菌系II包括菌株1、9、10、11、12、8、6、7(bootstrap=66%)；菌系II包括3、4、13(bootstrap=96%)。在F.mangiferae中，菌系II的菌株均來自云南省華坪地區(qū)，菌系I的菌株則主要來自海南地區(qū)，菌系III中的3、4號(hào)菌株來自廣西百色，而13號(hào)菌株則來自海南三亞。

圖1　基于Histone H3基因片段構(gòu)建芒果鐮孢菌的最小進(jìn)化樹Fig. 1　 Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from Histone H3 sequences data

2.2IGS片段分析采用鐮孢菌基因內(nèi)間隔區(qū)IGS引物NL11和CNS1[12]，對(duì)來自我國芒果花序的30株鐮孢菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約2 200 bp的基因片段。以甘蔗鐮孢菌F.sacchari菌株NRRL13999為外群，采用MEGA 6.0構(gòu)建最小進(jìn)化樹(圖2)?；贗GS區(qū)構(gòu)建的最小進(jìn)化樹與Histone H3構(gòu)建的最小進(jìn)化樹基本一致，結(jié)合Histone H3基因片段的最小進(jìn)化樹，將全部F.mangiferae分為3個(gè)譜系：I、II、III。IGS片段最小進(jìn)化樹中，譜系II依然形成一個(gè)單系群(bootstrap=100%)，而與來自廣西、海南的菌株分開(bootstrap =51%)。菌系I發(fā)生非常豐富的多樣性分化，其中包括來自海南和廣西的菌株。菌系III出現(xiàn)分化，13號(hào)菌株與菌系I親緣關(guān)系更近。

圖2　基于IGS基因片段構(gòu)建我國芒果鐮孢菌的最小進(jìn)化樹Fig. 2　Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from IGS sequences data

3結(jié)論與討論

目前已報(bào)道的病原鐮孢菌有4種：F.mangiferae，F(xiàn).mexicanum，F(xiàn).sterilihyphosum以及F.pseudocircinatum[6-8,10]。我國發(fā)生的芒果花序畸形病主要由F.mangiferae引起[9]。鐮孢菌Histone H3是一個(gè)相對(duì)更為保守的區(qū)域，種內(nèi)分歧較小，而IGS區(qū)域種內(nèi)分歧較大，適于種內(nèi)群體的研究。采用IGS和Histone H3 2種基因片段對(duì)采自云南、廣西、海南的芒果花序上分離的鐮孢菌進(jìn)行遺傳多樣性分析?；?個(gè)基因片段分別構(gòu)建我國芒果鐮孢菌的最小進(jìn)化樹，基于Histone H3的最小進(jìn)化樹上所有芒果鐮孢菌形成3個(gè)譜系，而IGS最小進(jìn)化樹上芒果鐮孢菌的種內(nèi)分化明顯，形成更豐富的多樣性，表明在芒果鐮孢菌中Histone H3基因片段較IGS更為保守。為了便于分析，以Histone H3的最小進(jìn)化樹為標(biāo)準(zhǔn)，將所有芒果鐮孢菌分為3個(gè)譜系：I、II、III。所有來自我國芒果花序畸形病重災(zāi)區(qū)云南省華坪縣的菌株均在譜系II中，無論在Histone H3還是IGS系統(tǒng)分析中均未發(fā)生遺傳分化，說明來自華坪的致病性芒果鐮孢菌遺傳信息較為單一，可能是單一來源的，即發(fā)生在華坪縣的芒果花序畸形病可能是從一個(gè)地區(qū)一批次傳播到該地區(qū)的。譜系I在我國海南地區(qū)普遍存在，且遺傳分化明顯，具有豐富的遺傳多樣性。譜系III菌株主要來自廣西和海南，但用于研究的菌株較少，未見明顯的遺傳分化和多樣性。譜系I和譜系III菌株主要分布在廣西和海南，但未見明顯的芒果花序畸形病的癥狀。

該研究發(fā)現(xiàn)我國芒果鐮孢菌遺傳多樣性非常豐富，分化程度極高，這可能與芒果的東南亞起源以及在我國具有悠久的種植歷史有關(guān)，芒果鐮孢菌在與芒果的長期共存中發(fā)生遺傳分化。

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收稿日期2015-12-04

作者簡介吳丹妮(1994- )，女，黑龍江虎林人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。 *通訊作者，講師，博士，從事真菌分類學(xué)研究。

基金項(xiàng)目中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(DC201502070301); 大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(S2014055)。

中圖分類號(hào)S 188+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-234-02