CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT在肺結(jié)核病中的診斷價(jià)值

王金湖,楊劍虹,李曉紅,曹季軍,潘曉園

(太倉市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇太倉 215400)

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·臨床研究·

CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT在肺結(jié)核病中的診斷價(jià)值

王金湖,楊劍虹,李曉紅,曹季軍,潘曉園

(太倉市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇太倉 215400)

摘要:目的探討CFP10/ESAT6融合蛋白-酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)和結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))在肺結(jié)核病中的診斷價(jià)值。 方法應(yīng)用ELISPOT和PPD試驗(yàn)檢測30例結(jié)核患者、54例非結(jié)核患者和37例健康者，比較兩者的診斷價(jià)值。結(jié)果國產(chǎn)試劑盒CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT檢測30例結(jié)核患者、54例非結(jié)核患者和37例健康者的陽性率分別為70.0%、18.5%和13.5%，PPD試驗(yàn)檢測的陽性率分別為60.0%、29.6%和29.7%。在30例結(jié)核患者中ELISPOT和PPD試驗(yàn)的靈敏度分別為70.0%和60.0%。在54例非結(jié)核組和37個(gè)健康組中ELISPOT和PPD試驗(yàn)的特異性分別為83.5%和70.3%。結(jié)論國產(chǎn)試劑盒CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT在肺結(jié)核的診斷中具有高靈敏度和特異性。

關(guān)鍵詞:CFP10/ESAT6融合蛋白;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT);PPD試驗(yàn);肺結(jié)核病

目前結(jié)核病仍是全球性面臨的傳染性疾病之一，WHO公布的2010年全球新增TB達(dá)到880萬[1]，而國內(nèi)有5.5億人受結(jié)核分枝桿菌感染，其中4 500萬為活動(dòng)性結(jié)核[2]。結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))一直被用于結(jié)核感染和活動(dòng)性結(jié)核診斷的體內(nèi)免疫試驗(yàn)，但由于PPD是多種抗原的混合物，受到非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗及機(jī)體內(nèi)免疫因素的影響，導(dǎo)致PPD試驗(yàn)診斷結(jié)核感染的特異性和靈敏度較差。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)通過特異的相對(duì)分子質(zhì)量6×103的早期分泌性抗原靶ESAT-6和培養(yǎng)濾液蛋白CFP10體外刺激T淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素，由于其特異性和靈敏度高得到廣泛應(yīng)用[3-5]。本研究選用新的國產(chǎn)試劑盒基因工程重組CFP10/ESAT6融合蛋白作為刺激劑，檢測健康人群、非結(jié)核病患者和確診結(jié)核患者，回顧性分析ELISPOT在肺結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料2014年12月至2015年3月，選取太倉第一人民醫(yī)院收治的45例疑似結(jié)核病患者、120例非結(jié)核患者及30例體檢人群，所有受試者同時(shí)進(jìn)行國產(chǎn)試劑盒CFP10/ESAT6融合蛋白ELISPOT和PPD試驗(yàn)，對(duì)所有受試者的臨床診斷、PPD試驗(yàn)及ELISPOT檢測結(jié)果行回顧性分析。所有病例均為初治病例，無人類免疫陷缺病毒合并感染，結(jié)核病依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的肺結(jié)核病診斷和治療指南進(jìn)行診斷。

1.2方法ELISPOT：使用新鮮肝素鋰或枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管無菌抽取受試者外周靜脈血4～5 mL，顛倒使抗凝液和血液混勻待用。按(2～3)∶1的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細(xì)胞分層液的滅菌離心管中，在室溫下1 000 r/min離心20 min，形成分界面。吸取淋巴細(xì)胞層至滅菌離心管中，加入250 μL無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取10 μL細(xì)胞懸液加入40 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)，混勻后取10 μL臺(tái)盼藍(lán)混合細(xì)胞液，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后用無血清培養(yǎng)基配制濃度為2.5×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液待用。取出結(jié)核感染T細(xì)胞檢測國產(chǎn)試劑盒反應(yīng)板條、特異性刺激抗原、陽性對(duì)照刺激物平衡至室溫，每孔加入100 μL配制好的細(xì)胞懸液。將反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)18～20 h。將反應(yīng)板取出，洗滌液洗板后每孔中加入100 μL標(biāo)記抗體工作液，置37 ℃孵育1 h。再次洗滌液洗板后，每孔加入平衡至室溫的顯色液50 μL，置37 ℃閉光顯色15 min至斑點(diǎn)大小肉眼清晰可見。

當(dāng)陰性孔斑點(diǎn)數(shù)小于13個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)大于或等于16個(gè)，可判斷所檢測標(biāo)本為陽性；當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)大于或等于13個(gè)且小于或等于20個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)為陰性對(duì)照孔2倍，可判斷所檢測標(biāo)本為陽性。

PPD試驗(yàn)：選擇患者前臂屈側(cè)上1/3與中1/3交界處為注射部位，皮內(nèi)注射0.1 mL結(jié)核菌素純蛋白衍生物，72 h后觀察結(jié)果，測量硬結(jié)直徑，若硬結(jié)直徑大于或等于5 mm，判定為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)兩種診斷方法的吻合程度運(yùn)用K檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1臨床診斷回顧性病例分析受試者診斷結(jié)果。結(jié)核病組：男23例，女7例，平均年齡(55.2±23.5)歲，其中肺結(jié)核21例，結(jié)核性腹膜炎3例，結(jié)核性胸膜炎5例，淋巴結(jié)核1例。非結(jié)核組：男28例，女26例，平均年齡(57.9±20.6)歲，其中肺炎19例，支氣管哮喘10例，慢性阻塞性肺病9例，呼吸衰竭5例，糖尿病5例，帕金森氏病3例，肺惡性腫瘤3例。健康組：男20例，女17例，平均年齡(59.2±18.1)歲。

表1　　ELISPOT與PPD試驗(yàn)檢測陽性結(jié)果[n(%)]

表2　　結(jié)核病組ELISPOT與PPD試驗(yàn)檢測結(jié)果比較(n)

2.2ELISPOT與PPD試驗(yàn)靈敏度、特異性、診斷價(jià)值比較結(jié)果ELISPOT檢測30例結(jié)核病患者、54例非結(jié)核病患者和37例健康者的陽性率分別為70.0%、18.5%和13.5%，PPD試驗(yàn)檢測的陽性率分別為60.0%、29.6%和29.7%(表1)。3組陽性率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.8，P<0.05)。將30例結(jié)核病患者的ELISPOT與PPD試驗(yàn)檢測結(jié)果進(jìn)行四格表χ2檢驗(yàn)，兩組檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.44，P>0.05，見表2)。將54例非結(jié)核病患者和37例健康者的ELISPOT與PPD試驗(yàn)檢測結(jié)果進(jìn)行四格表χ2檢驗(yàn)，兩組檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.53，P<0.05，見表3)。

表3　　非結(jié)核病組及健康組ELISPOT與PPD試驗(yàn)

3討論

γ干擾素釋放分析試驗(yàn)是近十年來體外免疫試驗(yàn)在結(jié)核病診斷領(lǐng)域的成功應(yīng)用[3-5]。而本研究選用的國產(chǎn)試劑，其選用的結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原為基因工程重組CFP10/ESAT-6融合抗原。Wu[6]等評(píng)估了CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病患者和健康人群的診斷價(jià)值，其特異性為95.5%，肺結(jié)核敏感性為60.8%，肺外結(jié)核敏感性為33.3%。

本研究結(jié)合CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT和PPD試驗(yàn)，對(duì)121例受試者進(jìn)行比較性分析顯示。臨床回顧性分析，121例受試者包括30例結(jié)核病患者、54例非結(jié)核病患者和37例健康者。本研究結(jié)核病組中ELISPOT和PPD試驗(yàn)的陽性率分別為70.0%和60.0%，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而非結(jié)核病組和健康組中ELISPOT和PPD試驗(yàn)的特異性分別為83.5%和70.3%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT對(duì)結(jié)核病的診斷具有更高的臨床價(jià)值，尤其是在排除診斷方面。

有報(bào)道指出，進(jìn)口的Oxford T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)的靈敏度和特異性分別為90%和77%[7]。本研究CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT檢驗(yàn)特異性(83.5%)高于進(jìn)口的T-SPOT(77%)，這可能與ELISPOT閾值的設(shè)置提高有密切關(guān)系，其特異性得到明顯上升，可區(qū)分潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染[6]。

綜上所述，在肺結(jié)核診斷中，CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的PPD試驗(yàn)，且特異性更高，更快速，可以進(jìn)行高通量篩選。因此，CFP10/ESAT-6融合抗原的ELISPOT是良好的輔助診斷結(jié)核病的方法，值得推廣應(yīng)用。

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(收稿日期：2015-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.055

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)01-0116-02