一株鴨病毒性肝炎的分離和鑒定

張廣才

(山東省博興畜牧獸醫(yī)局，山東 濱州 256500)

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一株鴨病毒性肝炎的分離和鑒定

張廣才

(山東省博興畜牧獸醫(yī)局，山東 濱州 256500)

為確定發(fā)病鴨場的致病原，并對病原進(jìn)行分離與鑒定，將組織病料接種SPF雞胚成功分離到了1株病毒，分離株病毒對1%雞紅細(xì)胞無凝集性，分離株病毒的ELD50為10-4.83/0.1 mL，分離株病毒攻擊的雛鴨表現(xiàn)出鴨病毒性肝炎病毒感染的典型臨床癥狀和病理變化，RT-PCR檢測結(jié)果顯示分離株病毒為基因A型鴨甲肝病毒。

鴨；病毒性肝炎；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎主要感染1周齡內(nèi)雛鴨，以發(fā)病急、傳播快、病程短、發(fā)病率和死亡率高為主要特征[1]，每年都給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。在我國，該病的致病原主要是鴨甲肝病毒中的基因A型和C型[2]?，F(xiàn)對山東博興1例疑似感染鴨病毒性肝炎的病例進(jìn)行了臨床診斷，并采集病死鴨的肝臟等組織進(jìn)行了病毒的分離與鑒定，為發(fā)病鴨場找到了致病原因，也為基因A型鴨甲肝病毒新型疫苗、診斷試劑、卵黃抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

病料樣品來源：病料樣品采自山東博興某發(fā)病鴨場病死鴨的肝臟組織。主要試劑盒：病毒基因組RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。臨床診斷：觀察發(fā)病鴨場鴨的臨床癥狀和病理變化。病毒分離：無菌取死亡鴨的肝臟組織與滅菌生理鹽水以1∶3比例混合，研磨成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，棄去24 h內(nèi)死亡胚，死胚隨時取出放4℃保存，120 h后，收獲全部死胚尿囊液，連續(xù)傳3代，-20℃保存。分離毒株的血凝性測定：按常規(guī)方法測定第3代分離毒株的尿囊液對1%雞紅細(xì)胞的凝集性。分離毒ELD50測定：用滅菌生理鹽水將第3代分離毒的尿囊液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5，10-63個稀釋度分別接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接5枚，0.1 mL/胚，按Reed-Muench法測定分離毒株的ELD50。

致病性試驗(yàn)：取第3代分離毒的尿囊液按100 ELD50的接種劑量接種7日齡健康雛鴨10只，接種方法為頸部皮下注射，接種劑量為0.2 mL/只，取10只雛鴨接種滅菌生理鹽水作為對照。2組試驗(yàn)鴨均隔離飼養(yǎng)，觀察14天，觀察記錄試驗(yàn)鴨的發(fā)病、死亡情況，對死亡雛鴨剖檢，觀察病理變化。

RT-PCR檢測：根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]分別設(shè)計合成檢測鴨病毒性肝炎病毒I型和新型特異性檢測引物，利用病毒基因組RNA提取試劑盒提取第3代分離毒株尿囊液的病毒基因組RNA，以提取的RNA為模板，參照參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的RT-PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

臨床診斷結(jié)果：病鴨表現(xiàn)精神沉郁，采食減少或不食，喜臥，發(fā)病2～3天后出現(xiàn)死亡，死亡雛鴨呈角弓反張。對病死鴨剖檢可見肝表面有針尖大小出血點(diǎn)、肝臟極度腫大、質(zhì)脆。病毒分離結(jié)果：臨床病料接種SPF雞胚后48～72 h出現(xiàn)死亡，120 h后全部死亡，死亡雞胚胚體全身出血，肝臟嚴(yán)重出血、有明顯的壞死灶或壞死點(diǎn)。將無菌收集的第3代死亡鴨胚尿囊液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血凝性測定結(jié)果：分離毒株對1%雞紅細(xì)胞無血凝性。ELD50的測定結(jié)果：按Reed-Muench法測定第3代分離毒的ELD50為10-4.83/0.1mL。致病性試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)鴨在攻毒后24h開始出現(xiàn)食欲廢絕、精神萎靡、兩腳痙攣等臨床表現(xiàn)，至96h已死亡9只，致死率高達(dá)90%，死亡鴨呈現(xiàn)典型的角弓反張姿勢。解剖病死鴨可見肝臟出血、腫大、具有出血斑等典型的病理變化。對照組10只雛鴨全部健康，食欲、精神狀態(tài)均正常。分離毒株具有較強(qiáng)的致病性。RT-PCR檢測結(jié)果：按照參考文獻(xiàn)[3]的方法對第3代分離毒尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測， RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳可見大小為317 bp的擴(kuò)增條帶，與鴨病毒性肝炎I型的預(yù)期大小一致，即檢測結(jié)果為鴨病毒性肝炎I型陽性。

3 討論

鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病毒性傳染病，該病主要感染雛鴨，發(fā)病率和死亡率都很高。本研究分離毒株的獲得為鴨病毒性肝炎多價疫苗和多價高免卵黃抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。同時本研究顯示，利用10日齡SPF雞胚可以進(jìn)行鴨病毒性肝炎病毒的分離，表明鴨病毒性肝炎地方流行株適應(yīng)在SPF雞胚中繁殖。各型病毒引起鴨病毒性肝炎的臨床癥狀相似，給鴨病毒性肝炎的分型檢測增加了難度，本研究也證實(shí)RT-PCR檢測方法可以進(jìn)行鴨病毒性肝炎的分型檢測，可在分離毒株的分型鑒定和臨床鑒別診斷中推廣應(yīng)用。

[1] 于京平，曲曉杰. 鴨病毒性肝炎研究進(jìn)展[J].家禽科學(xué)，2015(12)：52-56.

[2] 張占龍，李敏，宋永鴻，等. 鴨甲肝病毒基因A型和C型雙價卵黃抗體的研制與保護(hù)效果研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015(9)：22-24.

[3] 柴順秀，馬花，韓英，等. 應(yīng)用RT-PCR方法檢測鴨病毒性肝炎新型和I型病毒[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報，2013，34(11)：64-67.

2016-09-26

張廣才(1984-)，男，山東濱州人，本科，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.12.098

S858.32

B

2095-9737(2016)12-0109-01