5-脂氧合酶的活性調(diào)節(jié)及抑制劑研究進(jìn)展*

秦華迪綜述，常　靜，秦春常△審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：.麻醉科；.心內(nèi)科，重慶40007）

5-脂氧合酶的活性調(diào)節(jié)及抑制劑研究進(jìn)展*

秦華迪1綜述，常靜2，秦春常2△審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.麻醉科；2.心內(nèi)科，重慶400017）

花生四烯酸鹽5-脂氧合酶；脂氧合酶抑制劑；活化；調(diào)節(jié)；綜述

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LO）是催化花生四烯酸（AA）生成具有生物活性的白三烯（leukotrienes，LTs）的關(guān)鍵酶［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，5-LO的調(diào)節(jié)在哮喘、炎癥、過敏性鼻炎、組織缺血再灌注損傷、心血管疾病及部分惡性腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均有非常重要的意義［2］。因此，關(guān)于5-LO酶活性的調(diào)節(jié)和抑制劑的研發(fā)已成為一個(gè)熱門課題，本文就其活性調(diào)節(jié)和抑制劑的研究進(jìn)展綜述如下。

1　5-LO酶活性的調(diào)節(jié)

1.15-LO5-LO在哺乳動(dòng)物各組織中分布十分廣泛，其相對分子質(zhì)量為72×103～80×103，是由672或673個(gè)氨基酸殘基組成的單體酶，主要由N-末端的β-barrel結(jié)構(gòu)和催化區(qū)域C-末端的α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成。α螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)含有1個(gè)非血紅蛋白Fe2+，是反應(yīng)時(shí)電荷的供體和遞體。氨基端擁有C2結(jié)構(gòu)含有典型配體結(jié)合環(huán)，配體結(jié)合環(huán)能與Ca2+和細(xì)胞膜相結(jié)合［3］，Ca2+通過誘導(dǎo)5-LO與細(xì)胞膜相結(jié)合，從而激活5-LO。靜息狀態(tài)下的5-LO在不同的細(xì)胞分布不同，如在中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞或腹膜巨噬細(xì)胞中，5-LO最主要分布在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域；而在肺泡巨噬細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞中，5-LO主要分布在細(xì)胞核區(qū)域。

1.2鐵離子與脂質(zhì)過氧化物5-LO活化中心的非血紅素鐵離子是5-LO激活所必需的，Hammarberg等［4］通過電子順磁共振發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下呈Fe2+形式，激活狀態(tài)下呈Fe3+形式，在催化過程中鐵離子在＋2價(jià)和＋3價(jià)之間循環(huán)。在細(xì)胞中，脂質(zhì)過氧化物能氧化5-LO中的Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+，使5-LO具有生物活性，但過氧化氫對5-LO無激活作用。Radmark等［5］發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶可以通過減少脂質(zhì)過氧化物的生成抑制5-LO的活性。

1.3Ca2+5-LO的活性與Ca2+有關(guān)，當(dāng)Ca2+濃度為4～10μmol/L，全部 5-LO的活性可激活；Ca2+濃度為 1～2μmol/L，僅有一半5-LO的活性可激活。但即使無Ca2+，5-LO也具有一定的生物活性［6］。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的5-LO激活就不依賴于Ca2+。每分子5-LO最多可以與2分子Ca2+可逆結(jié)合。Ca2+還可以調(diào)節(jié)5-LO與脂質(zhì)氫過氧化物的親和力；Ca2+激活 5-LO需要磷脂酰膽堿（Phos phatidylcholine，PC）或類毛狀蛋白（coactosin-likeprotein， CLP）存在，如此Ca2+才能有效地綁定到“支架”上。Ca2+還可對抗谷胱甘肽過氧化物酶對5-LO活性的抑制［7］。此外Mg2+、Ba2+、Sr2+和Mn2+可以部分激活5-LO的活性，但這些+2價(jià)陽離子不屬于催化機(jī)制。

1.4三磷酸腺苷（ATP）最早發(fā)現(xiàn)對5-LO酶有激活作用的物質(zhì)是ATP，但單獨(dú)的ATP不能激活5-LO的活性，必須在Ca2+同時(shí)存在時(shí)才能激活5-LO。ATP與5-LO結(jié)合使5-LO酶活性增加，對5-LO酶具有穩(wěn)定作用，但目前ATP與5-LO的結(jié)合位點(diǎn)尚未確定。

1.5PCPande等［6］在人類白細(xì)胞中提純5-LO發(fā)現(xiàn)，PC能代替細(xì)胞膜作為5-LO活性的刺激因子，并且能穩(wěn)定5-LO活性酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，5-LO的C2結(jié)構(gòu)對陽性離子的PC的結(jié)合力高于陰性離子的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。無Ca2+時(shí)，雖然此時(shí)PC與5-LO的結(jié)合力最大，但這種結(jié)合不能激活5-LO［8］；Ca2+存在時(shí)，增加5-LO與PC結(jié)合的疏水性，變?yōu)椤吧a(chǎn)”模式［6］。有趣的是，加入膽固醇或膽固醇硫酸鹽可以抑制5-LO的活性［7］。

1.6甘油酯和CLP研究發(fā)現(xiàn)，多種甘油酯均可以激動(dòng)5-LO活性，但其中1-油酰基-2-乙?；?sn-丙三醇（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）作用最明顯。OAG主要作用于5-LO的C2區(qū)域［9］。Ca2+、磷脂、PC可以抑制OAG 對5-LO刺激效應(yīng)。同Ca2+一樣，OAG可對抗谷胱甘肽過氧化物酶對5-LO活性的抑制［10］。CLP是結(jié)合蛋白中的一員，CLP與5-LO的結(jié)合綁定需在完整的細(xì)胞中發(fā)生，5-LO與F-肌動(dòng)蛋白相競爭與CLP相結(jié)合。CLP可以上調(diào)激動(dòng)5-LO活性［11］。當(dāng)無PC時(shí)，CLP可以替代PC激活5-LO，當(dāng)CLP和PC同時(shí)存在時(shí)可以提高5-LO的活性，這是通過色氨酸殘基與5-LO的配體結(jié)合環(huán)相結(jié)合，即蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CLP、5-LO以靜息狀態(tài)存在于胞質(zhì)區(qū)域，給予Ca2+載體刺激后，5-LO、CLP轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核區(qū)域，因此，沒有Ca2+，CLP依然可以綁定5-LO，但需要Ca2+才能激活5-LO［12］。

1.75-LO激動(dòng)蛋白 （5-lipoxygenase actin protein，F(xiàn)LAP）FLAP相對分子質(zhì)量約為18×103，包含2個(gè)親水環(huán)和3個(gè)跨膜區(qū)，主要分布在細(xì)胞核膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。缺乏FLAP或給予FLAP抑制劑，5-LO就不能將內(nèi)源性的AA催化生成LTA4，因此，F(xiàn)LAP是激活5-LO所必需的。一些觀點(diǎn)認(rèn)為，F(xiàn)LAP除了能為5-LO與膜結(jié)合提供位點(diǎn)，還作為轉(zhuǎn)移蛋白結(jié)合AA，呈遞給5-LO。FLAP能增強(qiáng)5-LO的生物活性［13］。

1.85-LO的磷酸化5-LO的氨基酸序列包含有幾個(gè)蛋白激酶的序列，5-LO的磷酸化受到激酶A（PKA）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）調(diào)節(jié)的MAPKAPK-2/3、ERK1/2的調(diào)節(jié)。給予細(xì)胞刺激（如細(xì)胞應(yīng)激、佛波醇酯），激活MAPKAPKs和ERKs誘導(dǎo)Ser271或Ser663磷酸化，促使5-LO異位，提高5-LO的活性，但易被蛋白激酶抑制劑所抑制［14］。細(xì)胞中，磷酸化的5-LO在很低的Ca2+濃度即可激活5-LO活性［15］。當(dāng)5-LO中Ser271或Ser663突變?yōu)楸彼釙r(shí)，5-LO被p38MAP KAPK磷酸化明顯減少；外源性的腺苷和cAMP可激活PKA誘導(dǎo)Ser523磷酸化，細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的5-LO活性均可直接抑制［14］。AA和油酸可以促進(jìn)Ser271、Ser663磷酸化，同時(shí)抑制Ser523磷酸化，使5-LO活性增加，提高5-LO產(chǎn)物的合成［16］。

2　5-LO及其產(chǎn)物抑制劑

為了干預(yù)5-LO的活性及其產(chǎn)物的合成，5-LO及其產(chǎn)物抑制劑主要從以下3個(gè)途徑抑制：抑制cPLA2酶、FLAP抑制劑及直接抑制5-LO。

2.1cPLA2酶抑制劑cPLA2酶抑制劑，如糖皮質(zhì)激素可抑制所有類花生酸的形成，cPLA2基因敲除小鼠也能抑制類花生酸合成。盡管實(shí)驗(yàn)中糖皮質(zhì)激素可明顯減少類花生酸，但在臨床研究中，cPLA2酶抑制劑對抑制LTs生成是無效的。有研究結(jié)果顯示，選擇性cPLA2酶抑制劑雖然對關(guān)節(jié)炎［17］、急性肺損傷［18］和（或）缺血再灌注損傷［19］的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有一定的治療作用，但不能完全降低LTs水平。

2.2FLAP抑制劑FLAP抑制劑即通過拮抗FLAP，干擾其結(jié)合底物AA呈遞給5-LO，并且干擾5-LO與FLAP定位結(jié)合。在完整的細(xì)胞內(nèi)FLAP抑制劑能抑制5-LO的活性，尤其在AA是內(nèi)源性的［20］。相反，如果AA是外源性的就會(huì)損傷其功效。FLAP抑制劑對提純的5-LO不能抑制其產(chǎn)物生成。雖然FLAP抑制劑MK886、Bay-X 1005或MK0591對分離的白細(xì)胞有效，但是在血液化驗(yàn)中，藥效要弱50～200倍，可能由于血漿中其他蛋白競爭綁定藥物或AA。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LAP抑制劑AM103是一種強(qiáng)有效的和選擇性FLAP抑制劑，在體內(nèi)具有卓越的藥效性能，對急、慢性炎癥和休克動(dòng)物模型均有效［21］。FLAP抑制劑AM803是一種吲哚衍生物，目前已完成臨床治療哮喘第二階段的部分研究，有望進(jìn)入臨床使用［22-23］。

2.35-LO直接抑制劑

2.3.1抗氧化/游離基清除抑制劑這類抑制劑包括許多天然植物提取物（如咖啡酸、黃酮類、香豆素類等）及合成物（如AA-861、BW755C），這些藥物使催化中心的鐵離子始終保持在Fe2+狀態(tài)，不能進(jìn)入循環(huán)，從而抑制5-LO活性。它們均是5-LO的高效抑制劑，但缺乏合適的口服生物利用度，因?yàn)檫@類抑制劑非特異性地抑制了體內(nèi)普遍存在的氧化還原系統(tǒng)或活性自由基，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥等嚴(yán)重不良反應(yīng)，從而阻止這類藥物的廣泛運(yùn)用，發(fā)展緩慢。

2.3.2鐵配位體抑制劑鐵配位體抑制劑代表異羥肟酸或N-羥基脲衍生物，其不僅可螯合催化中心的鐵離子，還具有較微弱的還原性能力，其代表藥物Zileuton，有效的高選擇性5-LO抑制劑，半衰期為2.5 h，清除率為7.0mL/（min·kg），主要代謝途徑為N-羥基脲基團(tuán)的葡萄糖醛酸化。Zileuton（IC50=0.5～1.0μm）可改善急性或慢性哮喘患者的氣道功能，減少β受體激動(dòng)劑或糖皮質(zhì)激素的用量，但作為美國唯一批準(zhǔn)上市的5-LO抑制劑，其用于治療過敏性鼻炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效一般。VIA-2291已完成動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的二期臨床試驗(yàn)，有可能在臨床應(yīng)用［24］。將VIA-2291的結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到ABT-761，在支氣管痙攣的動(dòng)物模型上其作用強(qiáng)于Zileuton4～5倍，半衰期為16h，但其臨床應(yīng)用還有待開發(fā)。

2.3.3非氧化還原抑制劑非氧化還原抑制劑擁有與5-LO的自然底物不飽和脂肪酸類似結(jié)構(gòu)，從而與AA 或LOOH競爭結(jié)合5-LO，它們經(jīng)5-LO催化主要生成的代謝產(chǎn)物L(fēng)TB5的生物活性僅為LTB4的1%。模擬底物抑制劑分子結(jié)構(gòu)不同，本身缺乏氧化還原性能力，但卻不能排除其能改變5-LO的氧化還原狀態(tài)。其代表藥物有ZD2138、ZM230487屬于甲氧基四氫吡喃，該類藥物升高過氧化物濃度和（或）升高M(jìn)APKAPK-2/3、ERK1/2調(diào)控的5-LO磷酸化水平，可影響藥物對5-LO的抑制作用［25］。CJ-13610屬于咪唑類5-LO抑制劑，研究顯示，CJ-13610有很好的止痛效果，且不受5-LO磷酸化激活狀態(tài)的干擾，能更好地應(yīng)用于哮喘、癌癥等疾?。?6］。

3　小　結(jié)

5-LO及其代謝產(chǎn)物參與了許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，了解5-LO活性的調(diào)節(jié)及其抑制，對5-LO相關(guān)疾病的研究有著重要作用。目前，對5-LO活性調(diào)節(jié)的了解是有限的，5-LO抑制劑也存在著毒性反應(yīng)大、特異性低等問題，但相信不久的將來，有待研制出低毒、高效的5-LO抑制劑，造福人類的健康事業(yè)。

［1］Samuelsson B，Dahlén SE，Lindgren JA，etal.Leukotrienesand lipoxins：structures，biosynthesis，and biologicaleffects［J］.Science，1987，237（4819）：1171-1176.

［2］Sarveswaran S，Chakraborty D，Chitale D，etal.Inhibition of 5-lipoxygenase selectively triggers disruption of c-Myc signaling in prostate cancer cells［J］.JBiolChem，2015，290（8）：4994-5006.

［3］GilbertNC，BartlettSG，WaightMT，etal.The structure ofhuman 5-lipoxygenase［J］.Science，2011，331（6014）：217-219.

［4］Hammarberg T，Kuprin S，R?dmark O，etal.EPR investigation of the active site of recombinant human 5-lipoxygenase：inhibition by selenide［J］. Biochemistry，2001，40（21）：6371-6378.

［5］Radmark O，Samuelsson B.Regulation of5-lipoxygenaseenzymeactivity［J］.Biochem BiophysResCommun，2005，338（1）：102-110.

［6］Pande AH，Moe D，Nemec KN，etal.Modulation of human 5-lipoxygenase activity bymembrane lipids［J］.Biochemistry，2004，43（46）：14653-14666.

［7］Pande AH，Qin S，Tatulian SA.Membrane fluidity isa keymodulator of membrane binding，insertion，and activity of 5-lipoxygenase［J］.Biophys J，2005，88（6）：4084-4094.

［8］Bürkert E，Arnold C，Hammarberg T，etal.The C2-likebeta-barreldomain mediates the Ca2+-dependent resistance of 5-lipoxygenase activity against inhibition by glutathione peroxidase-1［J］.JBiol Chem，2003，278（44）：42846-42853.

［9］KulkarniS，Das S，F(xiàn)unk CD，etal.Molecular basisof the specific subcellular localization of the C2-like domain of 5-lipoxygenase［J］.JBiol Chem，2002，277（15）：13167-13174.

［10］Hrnig C，Albert D，F(xiàn)ischer L，et al.1-Oleoyl-2-acetylglycerol stimulates 5-lipoxygenaseactivity via a putative（phospho）lipid binding sitewithin the N-terminal C2-like domain［J］.JBiol Chem，2005，280（29）：26913-26921.

［11］Rakonjac M，F(xiàn)ischer L，Provost P，etal.Coactosin-like protein supports 5-lipoxygenase enzyme activity and up-regulates leukotriene A4 production［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2006，103（35）：13150-13155.

［12］Provost P，Doucet J，Hammarberg T，et al.5-Lipoxygenase interactswith coactosin-like protein［J］.JBiolChem，2001，276（19）：16520-16527.

［13］Evans JF，F(xiàn)erguson AD，Mosley RT，etal.What'sall the FLAP about：5-lipoxygenase-activating protein inhibitors for inflammatory diseases［J］. Trends PharmacolSci，2008，29（2）：72-78.

［14］Luo M，Jones SM，Phare SM，et al.Protein kinase A inhibits leukotriene synthesis by phosphorylation of 5-lipoxygenase on serine 523［J］.JBiol Chem，2004，279（40）：41512-41520.

［15］Fischer L，PoeckelD，Buerkert E，etal.Inhibitorsofactin polymerisation stimulate arachidonic acid release and 5-lipoxygenase activation byupregulation of Ca2+mobilisation in polymorphonuclear leukocytes involving Src family kinases［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1736（2）：109-119.

［16］Flamand N，LuoM，Peters-Golden M，etal.Phosphorylation ofserine271 on 5-lipoxygenase and its role in nuclear export［J］.JBiol Chem，2009，284（1）：306-313.

［17］TaiN，Kuwabara K，KobayashiM，etal.Cytosolic phospholipase A2 alpha inhibitor，pyrroxyphene，displays anti-arthritic and anti-bone destructive action in amurinearthritismodel［J］.Inflamm Res，2010，59（1）：53-62.

［18］Nagase T，UozumiN，Aoki-Nagase T，etal.A potent inhibitor of cytosolic phospholipase A2，arachidonyl trifluoromethyl ketone，attenuates LPS-induced lung injury inmice［J］.Am JPhysiol Lung CellMol Physiol，2003，284（5）：L720-726.

［19］Bellido-Reyes YA，Akamatsu H，Kojima K，etal.Cytosolic phospholipase A2 inhibition attenuates ischemia-reperfusion injury in an isolated rat lungmodel［J］.Transplantation，2006，81（12）：1700-1707.

［20］Ferguson AD，McKeever BM，Xu S，et al.Crystal structure of inhibitorbound human 5-lipoxygenase-activating protein［J］.Science，2007，317 （5837）：510-512.

［21］Lorrain DS，Bain G，Correa LD，etal.Pharmacologicalcharacterization of 3-［3-tert-butylsulfanyl-1-［4-（6-methoxy-pyridin-3-yl）-benzyl］-5-（pyridin-2-ylmethoxy）-1H-indol-2-yl］-2，2-dimethyl-propionic acid（AM103），a novel selective 5-lipoxygenase-activating protein inhibitor that reduces acuteand chronic inflammation［J］.JPharmacol Exp Ther，2009，331（3）：1042-1050.

［22］Bain G，King CD，Schaab K，et al.Pharmacodynamics，pharmacokinetics and safety of GSK2190915，a novel oral anti-inflammatory 5-lipoxygenaseactivating protein inhibitor［J］.Br JClin Pharmacol，2013，75（3）：779-790.

［23］Kent SE，Boyce M，Diamant Z，et al.The 5-lipoxygenase-activating protein inhibitor，GSK2190915，attenuates the early and late responses to inhaledallergen inmild asthma［J］.Clin Exp Allergy，2013，43（2）：177-186.

［24］B?ck M.Inhibitors of the 5-lipoxygenase pathway in atherosclerosis［J］. Curr Pharm Des，2009，15（27）：3116-3132.

［25］Werz O，Steinhilber D.Development of 5-lipoxygenase inhibitors—lessons from cellular enzyme regulation［J］.Biochem Pharmacol，2005，70（3）：327-333.

［26］Fischer L，Steinhilber D，WerzO.Molecular pharmacological profile of the nonredox-type5-lipoxygenase inhibitorCJ-13，610［J］.Br JPharmacol，2004，142（5）：861-868.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.02.017

A

1009-5519（2016）02-0209-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30900606）。

，E-mail：QCC3011@hotmail.com。

2015-05-25

2015-11-15）