14-3-3γ對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷的保護作用

王莉萍　王俊萍

(西安交通大學附屬紅會醫(yī)院心內(nèi)科，陜西　西安　710054)

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14-3-3γ對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷的保護作用

王莉萍王俊萍1

(西安交通大學附屬紅會醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安710054)

摘要〔〕目的研究14-3-3γ在異丙腎上腺素(Iso) 誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷中的保護作用。方法構(gòu)建pcDNA3.1-14-3-3γ重組載體，使用pcDNA3.1-14-3-3γ或pcDNA3.1對體外培養(yǎng)的H9c2(2-1)細胞進行轉(zhuǎn)染。實驗分為四組：pcDNA3.1-14-3-3γ+Iso損傷組，pcDNA3.1+Iso損傷組，Iso損傷組及空白對照組(未經(jīng)任何處理細胞組)。Western印跡檢測心肌細胞中14-3-3γ的表達情況；MTT法檢測心肌細胞增長率；取培養(yǎng)液檢測各組細胞丙二醛(MDA)含量變化和超氧化物歧化酶(SOD)活性變化；流式細胞法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果Iso損傷使心肌細胞的MDA含量顯著增加、SOD活性降低、細胞增長率降低、細胞凋亡增加，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ重組質(zhì)粒后再進行Iso損傷，則MDA含量顯著減少、SOD活性增高、細胞增長率增高、細胞凋亡減少(P<0.05)。結(jié)論14-3-3γ對Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞損傷有明顯的對抗和保護作用。

關(guān)鍵詞〔〕14-3-3γ；心肌損傷；異丙腎上腺素

1陜西省友誼醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：王莉萍(1969-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心血管疾病研究。

在我國，心腦血管疾病已成為僅次于惡性腫瘤的第二殺手。心肌細胞凋亡普遍參與心血管系統(tǒng)的發(fā)生與發(fā)展，是多種心血管疾病的重要病理生理機制之一〔1〕。異丙腎上腺素(Iso) 是一種β受體激動劑〔2〕。Iso在心衰患者體內(nèi)出現(xiàn)異常高表達，進一步在動物模式實驗中研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠的心肌細胞通過Iso誘導(dǎo)能引起細胞損傷〔3〕。Iso是一種人工合成的兒茶酚胺類物質(zhì)，常用于建立缺血性心臟病及心力衰竭的動物模型〔4～6〕。14-3-3蛋白是一種高度保守的酸性二聚體可溶性蛋白家族〔7〕，此類蛋白是一類廣泛存在的調(diào)控因子，可通過與其他蛋白的相互作用參與細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、遷移、細胞凋亡等眾多生理過程的調(diào)節(jié)〔8～11〕。14-3-3蛋白家族在不同的生物中種類也不同，有2～13種不等〔12〕。在哺乳動物中14-3-3有7種亞型〔13,14〕，14-3-3γ是其中一種亞型，其作為細胞內(nèi)磷酸化作用的重要因子，參與多種病理生理過程。研究表明，14-3-3γ蛋白在主動脈受損的大鼠心肌組織中表達明顯上調(diào)〔15〕，提示其有可能在心肌組織的損傷修護及對損傷的反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。本研究通過構(gòu)建Iso誘導(dǎo)心肌損傷模型，研究14-3-3γ對心肌細胞Iso損傷的保護作用及其作用機制。

1材料與方法

1.1細胞系及載體大鼠心肌細胞H9c2(2-1)購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)；載體pcDNA3.1購于Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。Iso購于Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司。AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購于BD公司(San Diego,USA)；山羊抗鼠14-3-3γ和β-actin一抗，HRP-標記的兔抗山羊二抗購于美國Pierce公司。

1.2構(gòu)建含有14-3-3γ的表達質(zhì)粒提取H9c2(2-1)細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。引物信息如下：上游引物5′-AAG AAT TCC CCC GCG AAG ATG-3′，下游引物5′-TTA GGT ACC TGG GGC CTT AGT TGT T-3′。引物設(shè)計中在上、下游分別引入EcoR Ⅰ與Kpn Ⅰ的酶切位點及保護性堿基。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切PCR擴增得到的目的基因及質(zhì)粒載體pcDNA3.1，分別收集目的片段后使用T4連接酶進行連接，構(gòu)建重組pcDNA3.1-14-3-3γ質(zhì)粒，并進行酶切鑒定和測序鑒定。

1.3細胞培養(yǎng)及分組處理大鼠心肌細胞H9c2(2-1)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為4組：(1)正常對照組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，未經(jīng)Iso處理；(2)Iso誘導(dǎo)心肌損傷組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L的Iso，孵育6 h；(3)Iso誘導(dǎo)心肌損傷+pcDNA3.1組：空載質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染H9c2(2-1)細胞24 h后處理同Iso誘導(dǎo)心急損傷組；(4)Iso誘導(dǎo)心肌損傷+pcDNA3.1-14-3-3γ組：重組質(zhì)粒pcDNA3.1-14-3-3γ轉(zhuǎn)染至H9c2(2-1)細胞中，24 h后處理同Iso誘導(dǎo)心急損傷組。

1.4Western印跡檢測蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在Iso誘導(dǎo)處理前進行Western印跡，檢測H9c2(2-1)細胞中14-3-3γ蛋白的表達。用放射免疫沉淀法(RIPA)細胞蛋白裂解液裂解各組H9c2(2-1)細胞，提取聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。以β-actin為內(nèi)參，同等量蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，進行電轉(zhuǎn)膜，先后結(jié)合山羊抗鼠14-3-3γ/β-actin一抗和HRP-標記的兔抗山羊二抗，最后X 線膠片曝光分析，檢測目的蛋白的表達水平。

1.5MTT比色法檢測細胞存活率胰酶消化分組處理的H9c2(2-1)細胞制備單細胞懸液，每組細胞以6×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細胞融合達到80%左右時開始檢測。原培養(yǎng)基吸棄后，每孔加入20 μl MTT〔5 mg/ml溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)〕，37℃恒溫箱中培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩10 min充分溶解藍色結(jié)晶。用酶標儀(Bio-tek Instruments/USA)在490 nm波長處測量其吸光值。

1.6丙二醛(MDA)含量測定酶聯(lián)法測定細胞MDA含量。按照MDA試劑盒使用說明測定H9c2(2-1)細胞的MDA含量。即收集細胞加入20% TCA孵育20 min。加入0.1 mol/L HCl和0.67%硫代巴比妥酸(TBA)于95℃水浴1 h，離心后在532 nm波長處測量其吸光值。

1.7超氧化物歧化酶(SOD)含量測定按照SOD試劑盒使用說明完成。每組細胞樣品加入水溶性四唑鹽(WST)工作液與酶工作液，于37℃恒溫箱中孵育20 min，在540 nm波長處測量其吸光值。

1.8流式細胞法檢測細胞凋亡用4℃預(yù)冷的PBS洗滌各組H9c2(2-1)細胞，加入0.25%胰酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化并收集細胞，加入1×Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液1 ml,離心后棄上清，加入結(jié)合緩沖液200 μl重懸細胞。在細胞懸液中加入Annexin V-FITC 10 μl PI(5 mg/L)5 μl，混合后37℃避光孵育30 min。以488 nm為激發(fā)波長，以530 nm為發(fā)射波長，用流式細胞儀檢測。

1.9數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1pcDNA3.1-14-3-3γ轉(zhuǎn)染心肌細胞后14-3-3γ蛋白表達顯著上調(diào)H9c2(2-1)細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ后，14-3-3γ蛋白表達(1.52 fold)較其他3組顯著上調(diào)(P<0.01)，正常對照組(0.62 fold)、Iso組(0.73 fold)、IsotpcDNA3.1組(0.75 fold)，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至H9c2(2-1)細胞(見圖1)。

圖1　轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ對Iso損傷心肌細胞后14-3-3γ蛋白表達的影響

2.2pcDNA3.1-14-3-3γ轉(zhuǎn)染誘發(fā)Iso損傷心肌細胞存活率顯著升高經(jīng)Iso處理的H9c2(2-1)細胞與正常對照組相比，細胞存活率(210% vs 100%)明顯下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ后經(jīng)Iso處理(86%)與單純Iso處理組(21%)及正常對照組相比，細胞存活率明顯升高(P<0.05)。

2.3pcDNA3.1-14-3-3γ轉(zhuǎn)染Iso損傷心肌細胞后MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高H9c2(2-1)細胞經(jīng)Iso處理后MDA的含量顯著增加(P<0.05)，SOD活性顯著降低；pcDNA3.1-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞后經(jīng)Iso處理與單純Iso處理組以及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1　轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ對Iso損傷心肌細胞后

與正常對照組比較：1)P<0.05;與Iso組比較：2)P<0.05

2.4轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ至Iso損傷心肌細胞后，細胞凋亡減少Iso處理使H9c2(2-1)細胞的凋亡明顯增加，pcDNA3.1-14-3-3γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞后經(jīng)Iso處理較之Iso處理組以及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細胞凋亡減少(見圖2)。

圖2　轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-14-3-3γ對Iso損傷心肌細胞后細胞凋亡的影響

3討論

心肌細胞的損傷是參與各種心血管疾病病理和生理的重要機制之一。Iso對心肌細胞具有強烈變時、變力效應(yīng)，對冠狀動脈微循環(huán)具有顯著的抑制效應(yīng)，且對心肌細胞具有直接的毒性效應(yīng)，可造成嚴重心肌損傷，甚至導(dǎo)致動物死亡。14-3-3蛋白是1967年發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的小分子二聚體〔16〕，有7個亞型，14-3-3γ是該家族中的一員。14-3-3γ幾乎存在于所有生物體細胞中，通過細胞內(nèi)磷酸化作用參與許多生理病理的調(diào)節(jié)過程〔17〕。已有研究結(jié)果顯示在心肌細胞損傷的乳鼠細胞中，14-3-3γ出現(xiàn)高表達的現(xiàn)象〔18〕。

本研究說明重組質(zhì)粒能在心肌細胞中有效表達。14-3-3γ可減少由Iso引起的MDA含量的增加，對Iso的細胞毒性有逆轉(zhuǎn)作用，對Iso細胞損傷有保護作用。SOD在細胞中有清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)14-3-3γ可增強SOD的活性，這一結(jié)果與MDA含量的減少相符合，因此，推斷14-3-3γ是通過降低細胞內(nèi)過量的自由基減輕心肌細胞受損傷的程度。14-3-3γ能使細胞逃避凋亡，明顯提高心肌細胞對抗Iso損傷的能力。

綜上，Iso會引起心肌細胞的損傷，但轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-14-3-3γ，可以通過清除細胞內(nèi)過量的自由基減輕心肌細胞受損傷的程度，說明14-3-3γ對Iso誘導(dǎo)的心肌細胞損傷有明顯的對抗和保護作用。

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〔2014-11-19修回〕

(編輯杜娟)

中圖分類號〔〕R542.2〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0042-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.019