NM23B對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外增殖的影響

高紅強(qiáng)　李志強(qiáng)　王海雷　薛國友　劉　靜　陳　剛　李　立

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽二科，云南　昆明　650011)

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NM23B對(duì)大鼠肝細(xì)胞體外增殖的影響

高紅強(qiáng)李志強(qiáng)王海雷薛國友劉靜陳剛李立

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽二科，云南昆明650011)

摘要〔〕目的觀察NM23B在體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞增殖中的作用。方法構(gòu)建NM23B過表達(dá)載體和干擾載體及其陰性對(duì)照載體，分別轉(zhuǎn)染SD大鼠BRL-3A肝細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組(CON)、干擾NC組(siRNA-NC)、干擾組(siRNA)、過表達(dá)組(OE)、過表達(dá)NC組(OE-NC)，通過定量PCR分析各組細(xì)胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA變化；Western印跡分析比較各組細(xì)胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期比例；用CCK 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果OE組Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表達(dá)量較CON組顯著增多(P<0.05)；另一方面，siRNA組的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表達(dá)量較CON組顯著降低(P<0.05)，干擾NC組和OE-NC組與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。OE組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于CON組(P<0.05)，siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于CON組(P<0.05)。同時(shí)，OE組的S期細(xì)胞比例明顯高于CON組(P<0.05)，siRNA組的S期細(xì)胞比例明顯低于CON組(P<0.05)，siRNA-NC組和OE-NC組與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖表明OE組的增殖速度明顯快于CON組(P<0.05)，siRNA組的增殖速度明顯慢于CON組(P<0.05)，siRNA-NC組和OE-NC組與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論過表達(dá)NM23B可以加強(qiáng)Cyclin D1、PCNA的表達(dá)，縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖；干擾NM23B表達(dá)則削弱了Cyclin D1、PCNA的表達(dá)，延長細(xì)胞周期，從而抑制肝細(xì)胞增殖。證實(shí)了NM23B在體外培養(yǎng)SD大鼠肝細(xì)胞增殖中的作用，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞〔〕NM23B;大鼠BRL-3A肝細(xì)胞;細(xì)胞周期;增殖

第一作者：高紅強(qiáng)(1981-)，男，住院醫(yī)師，在讀博士,主要從事肝移植臨床研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因NM23是一個(gè)多功能基因，目前對(duì)其在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、個(gè)體發(fā)育等方面功能的認(rèn)識(shí)日益增多〔1～4〕。NM23目前已發(fā)現(xiàn)10個(gè)亞型〔5〕，研究最透徹的是NM23A和NM23B，其編碼的蛋白分別為NM23B-H1(NDPK A)和NM23B-H2(NDPK B)，兩者雖然有88%的相同基因序列，但生物學(xué)功能上卻存在各自傾向性，NM23A抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，NM23B調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的已經(jīng)得到共識(shí)〔6〕。NDPK B蛋白可以結(jié)合正向或負(fù)向的轉(zhuǎn)錄元件而產(chǎn)生激活或抑制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控效果,還可以通過消除一些扭曲、有潛在抑制作用的DNA結(jié)構(gòu)來調(diào)控轉(zhuǎn)錄〔7,8〕，這就是NDPK B基因調(diào)控功能多樣性的分子基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建NM23B過表達(dá)載體及干擾載體，分別轉(zhuǎn)染SD大鼠BRL-3A肝細(xì)胞，驗(yàn)證NM23B在體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞增殖中的作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A購于昆明動(dòng)物研究所；Stbl3超級(jí)感受態(tài)及帶GFP的腺病毒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子流行病學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室制作；DMEM及胎牛血清購自美國Hyclone公司；PCR試劑盒購自廣州復(fù)能基因公司，PCR引物也由該公司設(shè)計(jì)；青霉素、鏈霉素購于美國Millipore公司；蛋白酶抑制劑及PVDF膜購于美國Millipore公司；PMSF、BCA試劑盒購于中國碧云天生物公司；鼠抗人β-actin抗體購自美國Abcam公司，anti-cyclinD1和anti-PCNA購于美國Millipore 公司，anti-NM23-H2購于美國Santa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建干擾載體及過表達(dá)載體合成委托專業(yè)公司廣州復(fù)能公司完成,并附有干擾及過表達(dá)的NC質(zhì)粒。慢病毒骨架質(zhì)粒(Tet-pLKO-puro )經(jīng)EcoRI及AgeI雙酶切，膠回收酶切的骨架質(zhì)粒，與退火形成的雙鏈干擾序列經(jīng)T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)入Stbl3超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，活化后進(jìn)行菌液PCR：上游引物5'-GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3'，下游引物5-'TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3'，取陽性菌液再擴(kuò)大培養(yǎng)行質(zhì)粒小提得到較純的重組慢病毒質(zhì)粒，并篩選出干擾性最好的質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3感染目的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(CON)、干擾NC組(siRNA-NC)、干擾組(siRNA)、過表達(dá)組(OE)、過表達(dá)NC組(OE-NC)。取對(duì)數(shù)生長的BRL-3A細(xì)胞種于六孔板內(nèi)，第2天細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí)感染病毒，換含有5%FBS(滅活)和1%雙抗，每孔加入500 μl病毒液，并加入8 μg/ml的polybrene。第2天重復(fù)感染一次，次日用嘌呤霉素的最低殺死濃度(1 μg/ml)進(jìn)行篩選。感染72 h后，用熒光顯微鏡觀察熒光。收集細(xì)胞:用胰酶(0.25%)消化轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,將細(xì)胞吹打形成單個(gè)細(xì)胞,加PBS,800 g離心5 min棄上清。再用PBS重新清洗2次。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.4PCR檢測(cè)收集慢病毒感染5 d后的3組細(xì)胞，分別取1×106個(gè)細(xì)胞按RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(PCR引物序列見表1)，各組樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件：第1步，95℃預(yù)變性15 s；第2步，95℃變性5 s、60℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)；以2-ΔΔCt表示目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　NM23B、PCNA、Cyclin D1引物序列

1.5肝細(xì)胞Western印跡分析收集慢病毒感染5 d后的5組細(xì)胞，各組分別取1×106個(gè)細(xì)胞，按蛋白提取試劑盒說明書提供的方法抽提細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取50 μg/孔蛋白進(jìn)行電泳,分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h；經(jīng)TBST充分漂洗后，分別加入目標(biāo)蛋白抗體；經(jīng)TBST充分漂洗后，加1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫反應(yīng)2 h；經(jīng)TBST充分漂洗后，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法試劑顯色。目的條帶與β-Actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期取慢病毒感染5 d后的5組細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板，每組3個(gè)復(fù)孔，終體積為500 μl，加入預(yù)冷的70%乙醇于4℃固定過夜，PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min,5 min，洗2遍，之后用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50 μg/ml，37℃溫浴30 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況按試劑盒說明書進(jìn)行操作：5組各取8個(gè)孔進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，采用96孔細(xì)胞鋪板，每孔100 μl 2 000個(gè)細(xì)胞，第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。每孔加入10 μl CCK-8溶液，分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在450 nm測(cè)定吸光度值，計(jì)算出吸光度相對(duì)值。

2結(jié)果

2.1熒光顯微鏡觀察慢病毒在體外肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況各組GFP陽性細(xì)胞率分別是CON組為(0.245±0.014)%，siRNA組為(86.816±3.536)%，siRNA-NC 組為(83.732±2.437)%，OE組為(89.353±4.239)%，OE-NC組為(91.417±4.725)%，除對(duì)照組外，其余各組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

A、B、C、D、E為白光照片,F、G、H、I、J為熒光照片圖1　熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染效果

2.2各組細(xì)胞PCR檢測(cè)OE組NM23B、PCNA及Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組顯著增多(均P<0.05)。 siRNA組的NM23B、PCNA及Cyclin D1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較CON組顯著降低(均P<0.05)。而CON組、OE-NC組及siRNA-NC組之間比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。2.3轉(zhuǎn)染后各組肝細(xì)胞Western印跡分析OE組NM23B、PCNA及Cyclin D1的蛋白表達(dá)量較CON組顯著增多(均P<0.05)。另一方面，SiRNA組的NM23B、PCNA及Cyclin D1蛋白表達(dá)量較CON組顯著降低(均P<0.05)。而CON組、OE-NC組及siRNA-NC組比較無顯著差異(P>0.05)。見表3、圖2。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期OE組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于CON組(P=0.001 4)，siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于CON組(P=0.003 4)。同時(shí)，OE組的S期細(xì)胞比例明顯高于CON組(F=542.68,P=0.018)，siRNA組的S期細(xì)胞比例明顯低于CON組(F=2 655.18,P=0.000 4)；而CON組、OE-NC組及siRNA-NC組間G0/G1期和S期的細(xì)胞比例無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表2　各組細(xì)胞NM23B、PCNA、Cyclin D1的

表3　各組細(xì)胞NM23B、PCNA、Cyclin D1的

與CON組比較：1)P<0.05，下表同

2.5CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖OE組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力(細(xì)胞增殖能力)都明顯強(qiáng)于CON組(均P<0.05)，而siRNA組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力(細(xì)胞增殖能力)則明顯弱于

CON組(均P<0.05)。CON組、OE-NC組及siRNA-NC組間在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力(細(xì)胞增殖能力)都無顯著差異(P>0.05)。見表5。

圖2　各組細(xì)胞NM23B、PCNA、Cyclin D1蛋白印跡

組別G0/G1期S期G2/M期KB組49.815±1.93441.346±2.1857.964±1.495siRNA-NC組51.283±2.31642.321±1.9346.317±0.982siRNA組66.719±3.7851)29.453±1.8461)2.753±1.518OE-NC組50.437±1.84639.913±2.3167.985±2.738OE組42.781±1.6371)48.671±1.6371)10.876±1.193

表5　各組細(xì)胞行CCK-8檢測(cè)后吸光度值

3討論

在活體肝移植、原發(fā)性肝癌、肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝硬化等情況下行肝部分切除術(shù)后常常出現(xiàn)肝臟儲(chǔ)備功能不足，導(dǎo)致肝衰竭。肝臟再生是多因子、多通路、多基因共同參與的復(fù)雜調(diào)控過程〔9〕,如何讓有限的功能完好的正常肝細(xì)胞最大限度地增殖是解決這個(gè)問題的一個(gè)思路，這就需要尋找更多的肝細(xì)胞增殖的調(diào)控靶點(diǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NM23B的高表達(dá)和低表達(dá)均能引起Cyclin D1和PCNA表達(dá)升高和降低，因此筆者推測(cè)NM23B通過直接或間接地調(diào)控Cyclin D1和PCNA的表達(dá)，從而影響大鼠肝細(xì)胞的增殖，至于其中涉及哪些信號(hào)通路和調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。流式細(xì)胞儀結(jié)果說明上調(diào)NM23B表達(dá)能使大鼠肝細(xì)胞快速進(jìn)入S期，縮短細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面，降低NM23B表達(dá)能阻礙大鼠肝細(xì)胞快速進(jìn)入S期，而停滯于G0/G1期，延長細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。綜上，本研究從正反兩個(gè)方面闡述了NM23B在體外肝細(xì)胞增殖中的作用。由于NDPK B在大鼠和人類之間有著98%的同源性，且在大鼠肝細(xì)胞中表達(dá)較為豐富〔10〕，因此NDPK B在大鼠肝細(xì)胞增殖的研究勢(shì)必為后續(xù)活體研究和人類肝細(xì)胞增殖的研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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〔2015-01-27修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：李立(1962-)，男，博士，主要從事肝膽胰外科及器官移植研究。

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(2012FB010)

中圖分類號(hào)〔〕R575〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0023-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.010