大電導(dǎo)鈣激活鉀通道介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖及其機(jī)制

楊國勛　李　志　劉唐威　李健玲　史吉瑩　錢　靜

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所，廣西　南寧　530021)

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大電導(dǎo)鈣激活鉀通道介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖及其機(jī)制

楊國勛李志劉唐威李健玲史吉瑩錢靜

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKca)是否通過Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)途徑影響兔主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖。方法用低濃度的四乙胺(TEA)處理體外傳代培養(yǎng)的家兔胸主動(dòng)脈VSMC。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測TEA對(duì)VSMC的增殖和細(xì)胞周期的影響，分別采用免疫組化法和免疫印跡法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(P-ERK1/2)蛋白表達(dá)。結(jié)果(1)MTT法檢測結(jié)果顯示，TEA能夠呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性地降低吸光值、增加細(xì)胞抑制率(P<0.05)；(2)流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果顯示，TEA處理48 h后能夠呈劑量依賴性地增加G1期細(xì)胞比例，減少S期、G2期細(xì)胞比例(P<0.05)；(3)免疫組化檢測結(jié)果顯示，隨著TEA濃度的增加，VSMC的PCNA陽性表達(dá)率逐漸下降(P<0.01)；(4)免疫印跡法結(jié)果表明，經(jīng)400 μmol/L的TEA處理48 h后，ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達(dá)，ERK活化率與未經(jīng)處理的對(duì)照組比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.354～1.035,P>0.05)。結(jié)論TEA可呈濃度依賴性地阻止細(xì)胞周期由G1向S期推進(jìn)，抑制VSMC增殖；該過程的分子機(jī)制不經(jīng)由Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)途徑介導(dǎo)。

關(guān)鍵詞〔〕血管平滑肌細(xì)胞；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；四乙胺；增殖

第一作者：楊國勛(1968-)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事高血壓、冠心病基礎(chǔ)與臨床研究。

誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡、抑制VSMC增殖是防治心血管疾病發(fā)生的理想靶點(diǎn)〔1，2〕。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKca)是VSMC上處于優(yōu)勢地位的離子通道，對(duì)于血管平滑肌的功能具有調(diào)節(jié)作用〔3〕。近來研究表明，BKca還介導(dǎo)VSMC的增殖過程，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明，可能與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)〔4〕。本研究擬觀察體外傳代培養(yǎng)的兔胸主動(dòng)脈VSMC中加入低濃度的四乙胺(TEA)阻斷BKCa后對(duì)VSMC增殖的影響以及ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化。

1材料與方法

1.1材料健康一級(jí)清潔家兔，體重2.5～3 kg，3～4月齡，雌雄不拘，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。TEA、噻唑鹽(MTT)為Sigma公司；胎牛血清為HyClone公司；α-actin單克隆抗體為武漢博士德公司；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體為博奧森公司；免疫組化試劑盒為北京中杉金橋公司；細(xì)胞周期試劑盒為美國BD公司；抗ERK1/2單克隆抗體，抗磷酸化ERK單克隆抗體為R&D公司；α-actin內(nèi)參抗體為Earthox公司。

1.2VSMC的分離、培養(yǎng)和鑒定采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)VSMC的原代細(xì)胞，在無菌條件下分離出胸主動(dòng)脈，去除內(nèi)、外膜，將中膜撕成2 mm左右的條狀。將其與0.2%的膠原酶Ⅰ20 ml一同放入50 ml的培養(yǎng)瓶中，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，血管松散后用吸管吹打制成含單個(gè)細(xì)胞的懸液，過濾、離心后用含20%胎牛血清的DMEM液制成細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用2～3代的VSMC細(xì)胞，經(jīng)光學(xué)顯微鏡和α-actin免疫組化技術(shù)進(jìn)行鑒定。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，分別用濃度為0、100、200、400 μmol/L TEA的10%胎牛血清培養(yǎng)液處理24、48、72 h。

1.4四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測細(xì)胞活性將生長良好的2～3代VSMC單細(xì)胞懸液接種于96孔板，密度為2×104個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)48 h后，用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度TEA，置入37℃孵箱培養(yǎng)分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入MTT繼續(xù)孵育5 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO),采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在酶標(biāo)測儀上讀取490 nm處的吸光值(A值)，并計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測VSMC周期將1×106個(gè)/ml經(jīng)不同濃度TEA血清培養(yǎng)制成的單細(xì)胞懸液，接種于6孔板上，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，0.125%胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min棄上清液，再加入1 ml PBS吹打，再離心1次。向收集細(xì)胞中加入4℃70%乙醇混勻，固定后PBS清洗，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/ml，4℃加入1 ml碘化丙啶(PI)避光染色25 min，500目銅網(wǎng)過濾，檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6免疫組化測PCNA細(xì)胞消化后，采用不同TEA濃度血清培養(yǎng)基制成密度為(1～5)×104/L細(xì)胞懸液，分別滴于24孔板圓片上，每組6孔，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出孔板按下列步驟進(jìn)行：PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X100室溫處理、3%H2O2處理，滴加一抗，試劑孵育(以上每步后均PBS漂洗3次×2 min)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染10 s，脫水、透明、封片，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7ERK1/2、P-ERK1/2蛋白含量的檢測采用免疫印跡法，將105～106個(gè)/ml經(jīng)不含乙二胺四乙酸(EDTA)消化酶消化的2～3代細(xì)胞，接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸盡孔內(nèi)液體，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對(duì)照組不加TEA，實(shí)驗(yàn)組加400 μmol/L TEA胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h吸凈培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液500 μl，充分裂解30 min，將細(xì)胞碎片與裂解液移至1.5 ml EP管中，1 200 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白含量,蛋白變性，十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，依次加入一抗、二抗進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)，經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影、定影后應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，蛋白水平以目標(biāo)蛋白與α-actin的比值(A%)來表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)的兔胸主動(dòng)脈VSMC形態(tài)與免疫組化鑒定顯微鏡下VSMC呈梭形形狀，有典型的谷峰樣生長；免疫細(xì)胞化學(xué)染色α-actin呈陽性，證實(shí)VSMC培養(yǎng)成功。見圖1。

圖1　兔血管平滑肌細(xì)胞的鑒定

2.2TEA作用后VSMC抑制率方差分析顯示：同一時(shí)間點(diǎn)不同TEA劑量間比較，TEA能夠呈劑量依賴性地增加細(xì)胞抑制率，同一TEA濃度不同時(shí)間點(diǎn)間比較，TEA能夠呈時(shí)間依賴性地增加細(xì)胞抑制率，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3TEA作用后對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響方差分析顯示：TEA能夠呈劑量依賴性地增加G1期細(xì)胞比例，減少S期、G2期細(xì)胞比例(P<0.05)。見表2。

表1　各組細(xì)胞間的細(xì)胞抑制率比較

與低濃度組比較:1)P<0.05；與中濃度組比較:2)P<0.05；與24 h比較:3)P<0.05；與48 h比較：4)P<0.05

表2　各組細(xì)胞間的細(xì)胞周期比例比較±s，n=3)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與低濃度組比較:2)P<0.05；與中濃度組比較:3)P<0.05

2.4免疫組化檢測PCNA表達(dá)對(duì)照組、低濃度組、中濃度、高濃度組PCNA陽性表達(dá)率分別為(49.67±3.51)%、(41.25±2.65)%、(32.67±2.08 )%、(22.33±2.52)%，各組比較均有顯著性差異(P<0.01)?？梢婋S著TEA濃度的增加，VSMC的PCNA陽性表達(dá)率逐漸下降。見圖2。

圖2　PCNA蛋白在VSMC的表達(dá)(免疫組化)

2.5免疫印跡法測定ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)VSMC中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(高濃度組)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ERK活化率(P-ERK1/2蛋白占ERK1/2蛋白表達(dá)的百分率)在兩組間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　血管平滑ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)

圖3　ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)

3討論

VSMC的增殖與異?；顒?dòng)在動(dòng)脈粥樣硬化等血管增殖性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。BKca是在VSMC中表達(dá)豐富的離子通道，具有調(diào)節(jié)激素和神經(jīng)遞質(zhì)釋放、調(diào)節(jié)血管張力等多種生理功能〔5〕，并介導(dǎo)了VSMC的增殖〔4〕。企圖通過調(diào)節(jié)BKca來影響VSMC的增殖是防治心血管疾病的重要策略之一。Ivanov等〔6〕報(bào)道，在大鼠小腦延髓池中注入表皮生長因子(EGF)，能上調(diào)血管平滑肌PCNA的表達(dá)，并被BKca特異阻斷劑iberiotoxin所阻斷，提示BKca通道介導(dǎo)了EGF引起的VSMC的增殖。TEA亦是BKca的阻斷劑，能夠阻斷BKCa的開放。文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕，高濃度TEA對(duì)鉀離子通道(Kca)類型的阻滯作用沒有特異性，而低濃度TEA對(duì)Kca通道才有特異的阻斷作用。TEA對(duì)于BKca通道的半數(shù)抑制濃度為200 μmol/L〔8〕。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇低濃度TEA 來阻斷BKca通道。

在TEA對(duì)VSMC增殖影響的研究中，錢濟(jì)先等〔9〕報(bào)道，采用Kca的阻斷劑TEA可以使體外培養(yǎng)的兔股靜脈VMSC增殖。但對(duì)于體外培養(yǎng)的人體支氣管MSC，應(yīng)用TEA阻斷Kca則對(duì)平滑肌細(xì)胞(MSC)的增殖和凋亡沒有明顯的作用〔10〕。本研究結(jié)果表明TEA可以阻止VSMC由G0/G1向S期推進(jìn)。同時(shí)，TEA亦呈濃度依賴性地提高VSMC的細(xì)胞抑制率，下調(diào)PCNA的表達(dá)，抑制了VSMC的增殖。與錢濟(jì)先等〔9〕的報(bào)道不一致?？赡苁怯捎谑褂昧瞬煌腡EA濃度所致。這也被肖娟等〔11〕應(yīng)用BKCa的特異性阻斷劑Iberiotoxin(IBTX) 抑制VSMC的增殖所證實(shí)。

VSMC增殖的有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍在不斷研究中。Liu等〔12〕報(bào)道，高鹽通過ERK1/2依賴途徑提高血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC增殖；蜂毒明肽抑制重組人血小板衍生生長因子-BB( PDGF-BB)誘導(dǎo)VSMC遷延與增殖亦通過抑制Akt和Erk信號(hào)途徑的活化〔13〕。但BKca離子通道與ERK1/2信號(hào)途徑的關(guān)系研究不多。Si等〔14〕報(bào)道，在體外培養(yǎng)的A7r5VSMC中，在促有絲分裂劑PDGF刺激后BKca/rKca1.1表達(dá)和功能的下調(diào)不需要ERK1/2的磷酸化；Fernández-Marino等〔4〕則發(fā)現(xiàn)，鎢酸鹽通過促進(jìn)ERK1/2磷酸化，減少PDGF誘導(dǎo)VSMC的增殖，當(dāng)用IBTX阻斷BKca后，則抑制了這種作用。而單獨(dú)使用IBTX時(shí)對(duì)PDGF誘導(dǎo)的VSMC的增殖沒有顯著的影響。本研究提示TEA抑制VSMC增殖、阻滯細(xì)胞周期由G0/G1向S期推進(jìn)不經(jīng)由Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)途徑介導(dǎo)。

綜上所述，離子通道BKca和Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)途徑均與VSMC的增殖有關(guān)，但在不同的病理生理?xiàng)l件下，它們相互間的作用關(guān)系不同，深入探討這些作用靶點(diǎn)及其關(guān)系對(duì)于抑制VSMC增殖達(dá)到防治心血管疾病有著重要的意義，BKca是否通過其他信號(hào)途徑影響VSMC增殖還有待研究。

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〔2015-05-21修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金 (No.2010GXNSFA013175)

中圖分類號(hào)〔〕R39〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0016-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.007