知母的植物組織培養(yǎng)

裴毅+楊雪君+聶江力+張偉+毛金楓+孫碩+劉艷軍

摘 要：為了建立知母組培快繁體系，以知母無菌的種子苗為外植體，篩選適宜的增殖、伸長、生根培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果顯示：最適宜增殖的培養(yǎng)基為MS + 0.5 mg·L-1 BA+30 g·L-1蔗糖；最適宜的伸長培養(yǎng)基為MS + 0.25 mg·L-1 BA + 0.5 mg·L-1 IAA + 30 g·L-1蔗糖；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS + 0.5 mg·L-1 IAA + 30 g·L-1蔗糖。本試驗(yàn)結(jié)果將為知母的繁育與推廣奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基；激素；增殖；外植體

中圖分類號：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.01.002

Abstract：In this study， Rhizoma anemarrhenae aseptic seedlings were selected as explants to establish the Rhizoma anemarrhenae tissue culture and rapid propagation system. The seedlings without root were inoculated on the proliferation mediums containing different hormones to selected the suitable medium. The seedlings from proliferation were transferred onto the mediums containing different hormones for elongation culture to selected the suitable medium. The test results showed that the most suitable proliferation medium was MS+0.5 mg·L-1 BA+30 g·L-1 sucrose， the most suitable elongation medium was MS+0.25 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 IAA+30 g·L-1 sucrose， the most suitable rooting medium was 1/2MS+0.5 mg·L-1 IAA +30 g·L-1 sucrose. The results will lay the foundation for the breeding and popularization of Rhizoma anemarrhenae.

Key words： culture mediums； hormones； proliferation； explants

知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge）為百合科知母屬，多年生宿根草本植物。知母以干燥根莖入藥，屬大宗常用商品藥材[1-2]。知母性味苦、甘、寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火，生津潤燥的功效[3]，可用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘。現(xiàn)代研究表明[4]，知母的化學(xué)成分主要為甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、多糖類等，能抑制血小板聚集，改善大鼠腦缺血再灌注損傷，同時(shí)具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利尿、預(yù)防肥胖等作用[5]。

本研究在建立知母種子萌發(fā)無菌苗的基礎(chǔ)上，探討植物生長調(diào)節(jié)劑對知母植株增殖及其愈傷組織誘導(dǎo)和再生的影響，為其試管苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材 料

知母種子由天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 知母無菌苗的制備 取知母飽滿、無病蟲害的種子，用70%乙醇進(jìn)行表面浸種30 s，再用40%的安替福民進(jìn)行表面消毒20 min。消毒完成后將種子用無菌水反復(fù)沖洗3次，每次15 min。將無菌水洗凈的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上，在溫度25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，12 h光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待種子發(fā)芽后長到5 cm高時(shí)取出備用。

1.2.2 知母的增殖培養(yǎng) 取長好的知母無菌苗，在超凈臺中將知母的根去除，并剪去較長的葉片，將處理好的無菌苗接種到誘導(dǎo)知母增殖的培養(yǎng)基上見表1。將接種好的材料放在25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，24 h光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)大約30 d后，統(tǒng)計(jì)每處理的增殖系數(shù)和生長情況，增殖苗的生長情況主要指再生苗的長勢，分為三級，其中一級為生長健壯；二級為生長速度一般；三級為生長緩慢，細(xì)弱[6]。增殖系數(shù)=增殖產(chǎn)生的芽數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.3 知母再生苗的伸長培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)出的知母小苗從外植體上切下，在超凈臺中將這些小苗轉(zhuǎn)接到含有不同激素的伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)見表2。培養(yǎng)條件同增殖培養(yǎng)，30 d后對知母小苗伸長培養(yǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。伸長苗的生長情況主要指苗的長勢，分為三級，其中一級為生長健壯；二級為生長速度一般；三級為生長緩慢，細(xì)弱。

1.2.4 知母的生根培養(yǎng) 待伸長培養(yǎng)的知母幼苗長到3～5 cm時(shí)，在超凈臺中將其轉(zhuǎn)移到含有不同生長素的生根培養(yǎng)基上見表3。生根培養(yǎng)條件同前面伸長培養(yǎng)，30 d后調(diào)查知母根數(shù)和生根質(zhì)量。生根質(zhì)量：質(zhì)量好的指所誘導(dǎo)出的根適于移栽成活，一般粗細(xì)適中，長度較長，生長勢強(qiáng)；相比為一般；最后為差。

2 結(jié)果與分析

2.1 知母增殖培養(yǎng)結(jié)果

知母植株外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，知母增殖出的小苗從其母株鱗莖處長出。經(jīng)過大約30 d的培養(yǎng)，對增殖結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體情況見表1。

從表1可以看出，知母在選用不同分裂素時(shí)增殖效果不同。其中，BA的效果明顯好于KT，不但增殖率明顯高于KT，而且從增殖苗生長情況來看，在KT培養(yǎng)基上生長出的知母苗普遍表現(xiàn)出生長緩慢、黃化且有玻璃化顯現(xiàn)，而在BA上的再生苗生長健壯，同時(shí)增殖系數(shù)也高。雖然在MS+1.0 mg·L-1BA上增殖系數(shù)較高，但從再生苗生長情況來看MS+0.5 mg·L-1BA作為最適的增殖培養(yǎng)基更好。

2.2 知母的伸長培養(yǎng)結(jié)果

知母伸長培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果見表2。知母增殖產(chǎn)生的小苗在不加激素的培養(yǎng)基上也能長高，但生長速度較慢，平均高度只有2.1 cm高；當(dāng)培養(yǎng)基中只加入分裂素，如加入低濃度的BA時(shí)伸長效果也不理想，而且再生苗生長細(xì)弱，黃化現(xiàn)象嚴(yán)重；只加入生長素時(shí)，知母苗很快生根，但苗生長也不很快，分析原因主要由于植株?duì)I養(yǎng)一部分轉(zhuǎn)移到根部所致；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入一定量的BA，并配合使用相應(yīng)濃度的IAA時(shí)，知母苗的生長速度明顯加快，而且生根現(xiàn)象也受到了抑制。比較表中幾種培養(yǎng)基配方，最適合知母伸長生長的為：MS+0.25 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1IAA。在此培養(yǎng)基上，知母苗不但生長迅速，同時(shí)也很健壯。

2.3 知母再生苗的生根培養(yǎng)

知母生根培養(yǎng)結(jié)果見表3。從生根數(shù)和平均根長來看，加入IAA的效果要好于加入NAA的效果；從生根質(zhì)量來看，在NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的根一般都既粗又短，生長緩慢，這類根移栽一般不能成活，而在IAA上生長的根都為正常根，移栽成活率高。因此，在選用生長素進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)選擇IAA。比較MS與1/2 MS對生根影響來看，1/2 MS更有利于生根培養(yǎng)，在其培養(yǎng)基上根生長速度較快，根的粗細(xì)均勻，分析原因可能是低滲透壓利于根的誘導(dǎo)與生長。綜合以上兩種情況，最適合誘導(dǎo)知母組培苗生根的培養(yǎng)基組合為1/2 MS + 0.5 mg·L-1IAA。

3 討 論

3.1 組培快繁中一般要經(jīng)過的培養(yǎng)步驟

一般組培快繁中要經(jīng)過3個(gè)步驟進(jìn)行。第一步是增殖培養(yǎng)。由于知母通過愈傷組織再生較為困難，本試驗(yàn)選用知母不帶根的種子苗作外植體。二是伸長培養(yǎng)。一般新增殖出的幼芽較小，不能直接用于生根培養(yǎng)，要經(jīng)過一個(gè)壯苗的過程，如本試驗(yàn)中知母增殖出的小苗就十分細(xì)小，必須要經(jīng)過進(jìn)一步培養(yǎng)才能生根[12]。如果在增殖培養(yǎng)基上經(jīng)過延長培養(yǎng)時(shí)間就能獲得適合生根的再生苗，也可不進(jìn)行伸長培養(yǎng)。三是生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)十分重要，因?yàn)闆]有正常生根的組培苗的快繁試驗(yàn)就不能視為成功，因此，不但要誘導(dǎo)出根，還要保證誘導(dǎo)出的根適于移栽，并獲得較高的移栽成活率。

3.2 增殖組培中確定培養(yǎng)基組合的原則

在進(jìn)行組培快繁時(shí)，前面的增殖率高并不能說明后面獲得的組培苗數(shù)量就大，一般越是增殖率較高的處理，其再生芽的長勢就越弱，這主要是營養(yǎng)競爭造成的，所以在進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)要兼顧增殖率和再生芽的質(zhì)量[8-9]。如本試驗(yàn)中筆者選擇了增殖系數(shù)略低的MS+0.5 mg·L-1BA培養(yǎng)基組合，而舍棄了獲得更高的增殖系數(shù)的MS+1.0 mg·L-1BA培養(yǎng)基。

3.3 生根培養(yǎng)中滲透壓與營養(yǎng)的均衡原則

在進(jìn)行組培苗的生根培養(yǎng)中，低滲透壓培養(yǎng)基有利于生根。但低滲透壓是通過降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量與蔗糖的用量來實(shí)現(xiàn)，這會造成植物的營養(yǎng)供應(yīng)的不足[10]。通常生長健壯的組培苗使用低滲透壓培養(yǎng)基可以正常生根，組培苗弱小的必須進(jìn)行壯苗培養(yǎng)后才可使用。

4 結(jié) 論

通過對知母的組培快繁研究，其繁殖過程要點(diǎn)可總結(jié)為：以知母無菌種子苗為外植體，接種到增殖培養(yǎng)基MS+0.5 mg·L-1BA上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將增殖培養(yǎng)出的小苗轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基MS+0.25 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1IAA上進(jìn)行伸長培養(yǎng)，將生長高度為3 cm的知母組培苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA上經(jīng)過30 d培養(yǎng)后，將組培苗進(jìn)行移栽。本試驗(yàn)結(jié)果將為知母的組培研究、繁殖與推廣奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]宋蕓，喬永剛，呂慧敏.藥用植物知母染色體核型分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（10）：104-106.

[2]黨小平，毛春芹，陸兔林，等.HPLC法測定生知母和鹽知母中芒果苷和菝葜皂苷元[J].中草藥，2009，40（2）：236-238.

[3]原源，陳萬生，孫連娜，等.不同產(chǎn)地知母中皂苷類成分的測定[J].中草藥，2006，37（10）：1574-1576.

[4]易博，孫赫，原源，等.RP-HPLC法測定知母黃柏藥材對中新芒果苷，芒果苷和鹽酸小檗堿[J].中草藥，2007，38（6）：856-858.

[5]王靖，葛盛芳，陳琦，等.知母多糖降血糖活性研究[J].中草藥，1996，27（10）：605-606.

[6] 賀美忠，王桂梅，楊富.桔梗組培快繁技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（12）：9-11.

[7] 張春麗，郭宇珍，何松林.植物組培環(huán)境調(diào)控與規(guī)?；缂夹g(shù)研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：22-24.

[8] 王云山，周美虹，康黎芳，等.火龍果莖段組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：455-458.

[9] 彭紹峰，周子發(fā)，張雁麗，等.制約牡丹組培苗移栽成活率的因素探討[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2010（3） ：91-92.

[10] 孫瑞芬，李天然，李堃，等.草莓組培快繁及葉片誘導(dǎo)植株再生研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2002，17（4）：49-53.