補陽還五湯對腓總神經損傷大鼠腓總神經中神經生長因子mRNA表達的影響▲

張 賽 梅曉云 周 嵐

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎理論教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

論著·基礎研究

補陽還五湯對腓總神經損傷大鼠腓總神經中神經生長因子mRNA表達的影響▲

張 賽 梅曉云 周 嵐

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎理論教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

目的 探討補陽還五湯對腓總神經損傷大鼠的腓總神經中神經生長因子(NGF)-mRNA表達的影響。方法 選取雄性無特定病原體級雄性SD大鼠48只分模型組、假手術組、彌可保組及補陽還五湯高、中、低劑量組各8只。除假手術組大鼠外，均建立腓總神經夾傷模型，術后假手術組與模型組分別用生理鹽水灌胃，彌可保組及各劑量補陽還五湯組分別給予相應藥物灌胃，其中補陽還五湯高、中、低劑量組所含生藥分別為25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，21 d后檢測大鼠腓總神經NGF-mRNA 表達情況。結果 假手術組、彌可保組與補陽還五湯低、中、高劑量組NGF-mRNA相對表達量明顯增高，分別是模型組的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；補陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組NGF mRNA相對表達量明顯高于模型組(P<0.05)，補陽還五湯高劑量組NGF mRNA相對表達量明顯高于彌可保組(P<0.05)。結論 補陽還五湯可明顯增強腓總神經損傷大鼠腓總神經中NGF-mRNA的表達,這可能是補陽還五湯可促進腓總神經損傷后的修復及再生、肢體功能恢復的機制之一。

腓總神經損傷；補陽還五湯；腓總神經；神經生長因子；mRNA；大鼠；中醫(yī)藥；雪旺細胞

周圍神經損傷后的再生與修復過程涉及多種因素且復雜多變。目前臨床上尚無較為理想的、可快速促進神經及其靶器官功能恢復的方法。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)與周圍神經病變的關系密切[1]，其作為神經營養(yǎng)因子中重要的一員，對神經元的生長、修復與再生意義重大。有關復方補陽還五湯促進周圍神經損傷修復的文獻報告日益增多[2]。我們通過建立大鼠腓總神經夾傷模型，并檢測神經NGF mRNA的表達，以了解補陽還五湯治療大鼠腓總神經損傷的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 無特定病原體級雄性SD大鼠48只，體重約200 g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證編號：2008001646760。均于無菌飼養(yǎng)室、恒溫20℃飼養(yǎng)。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組、假手術組、彌可保組及補陽還五湯高、中、低劑量組，每組8只。

1.2 主要實驗藥品 (1)在南京中醫(yī)藥大學藥學院制劑室制備補陽還五湯，采用黃芪120 g、當歸6 g、芍藥6 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g進行煎煮、提取并濃縮，浸膏比重為3.7 g/ml，將該浸膏放于4℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?2)將甲鈷胺片(彌可保，批號：H20041642，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，500 μg/片)溶解于雙蒸水中，配制成混懸液，濃度為62.5 μg/ml。錫紙包裝避光放置該溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 主要實驗試劑 Trizol購自Invitrogen公司(批號：15596-026)；焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)處理水購自南京森貝伽生物科技有限公司(批號：1001218)；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團有限公司(批號分別為：10023419，80109218，10009218)；SYBR Green PCR試劑盒、反轉錄試劑盒購自Thermo公司(批號分別為：K0223，K1622)；RNaseⅠ購自Fermentas公司(批號：EN0541)；PCR 引物由武漢谷歌生物公司合成。其他常規(guī)試劑均為國藥產品分析純。

1.4 實驗儀器 旋渦振蕩器(上海青浦瀘西儀器廠)、XW-80A微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司)、FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)(美國MP)、5424 R離心機(Eppendorf公司)、CFX Connect Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(BIO-RAD公司)、UPT優(yōu)普特實驗室超純水器，離心管及 10 μl、200 μl、1 000 μl槍頭等均為無RNA酶耗材。

1.5 腓總神經夾傷模型建立 在模型組、彌可保組及補陽還五湯高、中、低劑量組中建立模型。動物稱重并麻醉消毒備皮，取左股后正中作一1.5 cm切口，游離后充分暴露腓總神經股部，向下行腓總神經鉗夾術，以14 cm止血鉗上全齒鉗夾腓總神經3次，10 s/次且每次間隔10 s。擠壓損傷寬度為5 mm，損傷遠端標記后逐層縫合。全部模型由同一人同手法操作。而假手術組大鼠只進行脛前肌外皮切口并縫合，不夾傷內部腓總神經。

1.6 給藥方法 造模后第2天開始灌胃給藥，給藥劑量根據(jù)成人臨床使用劑量，根據(jù)每公斤體重占體表面積相對比值的換算公式計算：大鼠每日給藥劑量(mg/g)=成人每日給藥劑量(mg)×等效劑量比值(人對大鼠為0.018)/大鼠體重(g)。補陽還五湯高劑量組為臨床換算劑量的2倍量(25.92 mg/g)，高、中、低劑量組含生藥分別是25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，中藥浸膏均用生理鹽水稀釋至4 ml后灌胃。假手術組與模型組分別用4 ml生理鹽水灌胃。彌可保組藥物劑量為625 mg/g，終體積4 ml灌胃。給藥時間固定為每日上午9 ∶00，1次/d。

1.7 腓總神經指標檢測 應用實時熒光定量PCR檢測NGF mRNA的表達。

1.7.1 引物合成：磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因為參照基因。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的NGF基因序列及GAPDH基因序列，以Premier 5.0軟件設計引物,由武漢谷歌生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7.2 總RNA制備：術后灌胃21 d后處死大鼠，暴露腓總神經，沿神經損傷遠端取神經組織30 mg并放入凍存管中，置于液氮，后轉到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 互補DNA(complementary DNA，cDNA)的合成：將神經組織加入1 ml Trizol勻漿靜置，加入氯仿，12 000 r/min離心10 min，取上清。加入異丙醇，12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入乙醇洗滌沉淀棄上清。晾干加入適量焦碳酸二乙酯處理水溶解。合成cDNA的第一條鏈反應體系如下：首先消除總RNA中的DNA，需加入脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)1 μl、10×DNase Ⅰ 緩沖液1 μl、總RNA≤1 ng、焦碳酸二乙酯處理水n μl，調整溫度至37℃ 30 min。加 1 μl的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，調制溫度至65℃ 10 min；后加入1 μl的Oligo 18、1 μl的雙蒸水(ddH2O)，65℃加熱10 min，結束后迅速置于冰上冷卻。進行反轉錄，加入下列體系：全部RNA 500 ng；5×反應物緩沖液4 μl；Oligo 18引物1 μl；10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合物2 μl；RiboLock RNase抑制劑1 μl；RevertAid M-MuLV RT 1 μl；加入無酶ddH2O至20 μl；反應程序如下：溫度調至42℃ 60 min，上升至70℃ 5 min后冷卻到16℃，將反轉錄產物置于-20℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.4 定量PCR檢測 20 μl體系：將制備好的 cDNA 進行 PCR 擴增，擴增體系如下：將PCR擴增的預混和溶液(SYBR Green Mix)10 μl、上游引物 F 0.5 μl、下游引物 R 0.5 μl、cDNA模板1 μl、ddH2O 8 μl混勻，總體積20 μl，置于SLAN熒光定量PCR儀中。反應程序：升溫至95℃，3 min；95℃，1～3 s，退火至60℃，≥20 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。反應結束后保存數(shù)據(jù)。通過溶解曲線來判斷PCR反應的特異性。每個組分別做3次定量檢測，記錄下CT值，并最終計算出CT平均值、△CT、△△CT和2-△△CT。其中△CT=CT(NGF)-CT(GAPDH)，△△CT=△CT(各組)-△CT(模型組)，運用2-△△CT相對定量差異法統(tǒng)計各組與模型組NGF mRNA基因表達的差異。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用(x±s)來表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 術后大鼠一般情況 術后第2天所有大鼠手術側出現(xiàn)了足趾蜷縮、跛行。21 d后各組足趾明顯伸展，步態(tài)基本恢復正常，假手術組、彌可保組及補陽還五湯高、中、低劑量組大鼠精神狀態(tài)及毛發(fā)色澤均優(yōu)于模型組。除假手術組外，其余各組的手術側均呈現(xiàn)出不同程度的脛前肌肌肉萎縮。

2.2 治療后各組大鼠腓總神經的NGF基因表達情況 6組的NGF-mRNA基因相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，假手術組、彌可保組與補陽還五湯低、中、高劑量組NGF mRNA基因相對表達量較模型組明顯增高，分別是模型組的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；其中補陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組NGF mRNA相對表達量明顯高于模型組(P<0.05)，補陽還五湯高劑量組NGF mRNA相對表達量明顯高于彌可保組(P<0.05)。見表2。

表2 6組NGF-mRNA基因相對表達量的比較(x±s)

注：與模型組相比，*P<0.001，△P<0.01；與彌可保組相比，#P<0.001。

3 討 論

NGF是一種分子量為27 KD的多肽，是一個高度保守的蛋白家族[3]。其細胞效應通過細胞表面兩類截然不同的受體介導[4]，主要存在于交感神經元及部分感覺神經元所分布的靶區(qū)域內的細胞組織中。受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase，Trk)家族和NGF家族成員呈相對特異高親和結合，特別是TrkA和NGF結合[5]。NGF的另外一個受體P75NTR和NGF家族成員呈低親和結合。NGF是神經系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，是目前唯一明確化學結構的細胞生長調節(jié)因子，具有促進周圍神經損傷與修復作用[6]，其作用具體表現(xiàn)為：控制神經元的存活，促進神經元的分化，決定軸突的生長方向及營養(yǎng)作用。研究表明，NGF蛋白及其受體表達減少的同時周圍神經中的NGF基因表達也減少[7]。由于現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，以NGF-mRNA在神經組織中的表達情況來評估神經再生，其敏感性明顯高于檢測NGF的表達情況[8]。大量細胞和分子水平的研究證實神經再生離不開雪旺細胞的增殖[9]。而Heumann等[10]研究表明神經損傷后的NGF-mRNA的高表達主要來源于局部增殖的雪旺細胞。雪旺細胞分泌NGF以維持神經元生存和促進軸突再生，如周圍神經損傷后，雪旺細胞的增殖受阻，必然導致神經元的凋亡，抑制軸突的再生。

腓總神經損傷是病因病機和臨床表現(xiàn)可將其歸于中醫(yī)“痿證”范疇，周圍神經損傷，首先出現(xiàn)局部的氣滯血淤，受到其支配的遠端肌肉群由于失去神經的營養(yǎng)供應，便逐漸發(fā)展為萎縮和變性，此當屬本虛標實之證，病機為經氣不續(xù)、氣虛血滯，應以補氣活血化淤為治則。補陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》，是補氣活血的代表方，方中以大量補氣藥(黃芪120 g)搭配少量活血藥(桃仁、紅花、赤芍、川芎、地龍)，活血而不傷正，補氣活血通絡。有臨床研究報道補陽還五湯臨床廣泛用于腰腿疼痛麻痹、周圍神經性面癱、糖尿病周圍神經等病變，且療效確切[11]。本研究結果顯示，治療后21 d，補陽還五湯中劑量及高劑量組、彌可保組大鼠腓總神經的NGF-mRNA相對表達量明顯高于模型組(P<0.05)，而補陽還五湯高劑量組NGF-mRNA表達明顯高于彌可保組(P<0.05)，提示不同劑量的補陽還五湯均可增強腓總神經損傷大鼠的腓總神經中NGF-mRNA的表達，推測該方有可能促進NGF與新生雪旺細胞對潰變髓鞘的清除能力，同時使雪旺細胞的NGF-mRNA表達增加，從而促進軸突生長以加速神經的再生，使周圍神經的結構和功能得到了保護，這可能是其治療腓總神經損傷的重要靶點之一。

綜上所述，補陽還五湯可明顯增強腓總神經損傷大鼠腓總神經中NGF-mRNA的表達，這可能是補陽還五湯促進腓總神經損傷后的修復與再生以恢復肢體功能的機制之一。

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Effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury repairing

ZHANGSai1,MEIXiao-yun1,ZHOULan2

(DepartmentofBasicalTraditionalChineseMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023 210023,China)

Objective To explore the effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor(NGF) mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.Methods A total of 48 male specific pathogen free SD rats were divided into model group,sham operation group,methycobal group,high-dose Buyanghuanwu decoction group,medium-dose Buyanghuanwu decoction group and low-dose Buyanghuanwu decoction group,with 8 rats in each group.Common peroneal nerve crush models were established in all the rats except the rats in the sham operation group.After operation,sham operation group and model group were treated with normal saline by gavage,while methycobal group and all Buyanghuanwu decoction groups were given corresponding transgastric medication.And the pure drugs in the high-,medium- and low-dose Buyanghuanwu decoction groups were 25.92 mg/g,12.96 mg/g and 6.48 mg/g,respectively.NGF mRNA expression was determined in the common peroneal nerve of rats 21 days later.Results Relative expression levels of NGF mRNA in the sham group,methycobal group,low-,medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups increased significantly,and were 4.79 times,2.16 times,1.31 times,1.83 times and 3.41 times the relative expression levels in the model group respectively.Relative expression levels of NGF mRNA in the medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups and methycobal group were significantly higher than that in the model group(P<0.05),and relative expression level of NGF mRNA in the high-dose Buyanghuanwu decoction group was significantly higher than that in the methycobal group(P<0.05).Conclusion Buyanghuanwu decoction can significantly elevate NGF mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.It may be one of the mechanisms that Buyanghuanwu decoction can promote the repairing and regeneration of injured common peroneal nerve,and recovery of limb function.

Common peroneal nerve injury,Buyanghuanwu decoction,Common peroneal nerve,Nerve growth factor,Message RNA,Rat,Traditional Chinese medicine,Schwann cell

國家自然科學基金，青年科學基金項目(81302890)； 江蘇省高校自然科學基金面上項目(13KJB360003)；江蘇省自然科學基金面上項目 (BK2011816)； 高等學校博士學科點專項科研基金面上項目 (新教師類)(20123237120004)；南京中醫(yī)藥大學青年自然科學基金(12XZR09)

張賽(1988～)，女，碩士，見習醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)基礎理論。

梅曉云(1954～)，女，碩士，博士生導師，研究方向：中醫(yī)基礎理論，E-mail：xiaoyun663399@163.com。

R 651.3

A

0253-4304(2016)01-0007-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.02

2015-11-14

2015-12-30)