液基薄層細(xì)胞檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞塊技術(shù)診斷胸腹水腫瘤

尚芳芳，趙 輝，王 強(qiáng)，種道臣

液基薄層細(xì)胞檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞塊技術(shù)診斷胸腹水腫瘤

尚芳芳，趙 輝，王 強(qiáng)，種道臣

目的探討液基薄層細(xì)胞學(xué)與石蠟包埋細(xì)胞塊技術(shù)在胸腹水腫瘤診斷中的聯(lián)合應(yīng)用。方法對(duì)所有臨床送檢的胸腹水標(biāo)本進(jìn)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，同時(shí)將胸腹水沉積物制成石蠟包埋細(xì)胞塊，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，判斷細(xì)胞的良惡性，確定腫瘤細(xì)胞類型和組織起源。結(jié)果檢測(cè)476例胸腹水患者，單純液基薄層細(xì)胞學(xué)檢出良性病變310例，惡性90例，繼而進(jìn)行細(xì)胞塊的免疫組織化學(xué)染色，確定良性365例，惡性111例，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）；確定分型104例，與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（確定分型77例）比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；確定腫瘤細(xì)胞來源92例，與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（確定來源0例）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。結(jié)論液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)與石蠟包埋細(xì)胞塊技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)判斷胸腹水的腫瘤細(xì)胞良惡性及組織來源具有重要價(jià)值。

液基薄層細(xì)胞檢測(cè)；胸腔積液；腹水；細(xì)胞塊；免疫組化染色

胸腹水（胸腔積液和腹水）是胸腹腔臟器病變常見的臨床表現(xiàn)，其產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜。胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查由于對(duì)患者損傷較小，操作方法簡(jiǎn)單，檢查周期較短，已成為診斷腫瘤的重要方法。液基薄層細(xì)胞檢測(cè)早已廣泛用于胸腹水的檢測(cè)［1］，目前沉淀包埋石蠟切片法［2］及細(xì)胞塊免疫組織化學(xué)染色方法的應(yīng)用對(duì)于胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查準(zhǔn)確率有了很大提高。筆者所在醫(yī)院病理科自2010年9月以來，對(duì)476例胸腹水患者開展了細(xì)胞塊的制作及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，探討液基薄層細(xì)胞檢測(cè)及細(xì)胞塊的免疫組化染色技術(shù)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的檢出情況及確定腫瘤細(xì)胞的分型及來源情況，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料收集2010年9月—2014年5月解放軍第四〇一醫(yī)院臨床各科室送檢的胸腹水標(biāo)本476例，其中胸腔積液368例，腹水108例。年齡21～99歲。均做了離心沉渣包埋切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1．2 試劑所用一抗體包括CK7、CK20、TTF－1、NapasinA、villin、CDX2、CEA、MC、CR、CD68、ER 和MaxVision檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1．3 方法

1．3．1 液基細(xì)胞學(xué)檢查 取新鮮胸腹水置于2個(gè)10 ml離心管內(nèi)，每管8 ml，2000 r／min，離心10～15 min，棄去上清液，保留管底有用細(xì)胞，再加入大約細(xì)胞團(tuán)體積3倍的細(xì)胞基液。在漩渦混勻器上混勻10 s后，用移液器吸取15 ml在脫脂載玻片上涂片，涂片面積直徑為1．5 cm。涂片干燥后用95%乙醇固定30 min，HE染色，中性樹膠封固。

1．3．2 細(xì)胞塊制作方法 取胸腹水置于50 ml離心管內(nèi)，以2000 r／min的速度離心10 min，棄去上清液，留沉淀物在試管內(nèi)，加入95%乙醇，邊加邊搖動(dòng)，使沉淀物分散，再次放入離心機(jī)內(nèi)2000 r／min離心10 min倒出上清液，然后用藥匙取出沉渣用擦鏡紙包裹［3］，放入包埋盒內(nèi)，經(jīng)LEICA ASP300S全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟。按常規(guī)組織標(biāo)本的程序進(jìn)行包埋、切片，HE染色，中性樹膠封固。

1.3．3 免疫組化染色步驟 常規(guī)脫蠟水洗，加3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗；根據(jù)所應(yīng)用一抗的特殊需要，加0．05%胰酶在37℃條件下消化10 min或枸櫞酸緩沖液經(jīng)抗原修復(fù)，PBS沖洗；10%正常羊血清封閉，室溫孵育10 min，不沖洗；滴加一抗工作液CK7、CK20、TTF－1、NapasinA、villin、CDX2、CEA、MC、CR、CD68等覆蓋組織面，4℃冰箱過夜；PBS沖洗，二抗37℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制；復(fù)染細(xì)胞核、分化、脫水、透明、封固。

1.3.4 陽(yáng)性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn) 在普通光鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果，以10%以上的靶細(xì)胞（異型細(xì)胞或癌細(xì)胞）出現(xiàn)定位清晰的棕褐色或黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，完全不著色為陰性表達(dá)［4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

476例患者送檢標(biāo)本中，胸腔積液368例，腹水108例，經(jīng)液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，明確診斷良性病變310例，查見惡性腫瘤細(xì)胞90例，不能確定良惡性診斷的胸腹水病例76例。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞塊的免疫組織化學(xué)染色，確定良性胸腹水365例，惡性胸腹水111例（圖1）。兩種方法進(jìn)行比較，細(xì)胞塊的免疫組織化學(xué)染色檢出情況優(yōu)于液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15．40，P＜0．01，表1）。

表1 兩種方法對(duì)于476例胸腹水惡性腫瘤細(xì)胞檢出情況

圖1 標(biāo)本液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查

476例胸腹水經(jīng)液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，確定惡性腫瘤細(xì)胞90例，其中確定分型77例 （腺癌73例，小細(xì)胞癌4例），均未能確定惡性腫瘤細(xì)胞來源。繼而進(jìn)行細(xì)胞塊的免疫組織化學(xué)染色，確定惡性腫瘤細(xì)胞111例，其中確定分型104例（腺癌99例，小細(xì)胞癌4例，鱗癌1例），確定惡性腫瘤細(xì)胞來源92例（肺來源的腺癌47例、肺來源小細(xì)胞癌3例、肺來源鱗癌1例，胃腸道來源的腺癌30例，卵巢來源的腺癌9例，乳腺來源的腺癌2例）（圖2）。

兩種方法對(duì)于確定分型的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3．67，P＞0．05）；對(duì)于確定惡性腫瘤細(xì)胞來源的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝137．56，P＜0．01，見表2），細(xì)胞塊的免疫組化染色技術(shù)優(yōu)于液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查。

表2 兩種方法對(duì)于確定分型和來源的比較

3 討 論

液基薄層細(xì)胞檢查技術(shù)在胸腹水細(xì)胞制作方面已很成熟［5］。細(xì)胞涂片薄層，細(xì)胞收集率高，背景清晰，容易閱片。對(duì)于數(shù)量較多、較典型的腫瘤細(xì)胞診斷較明確。但對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞較少，沒有臨床病史依據(jù)或者對(duì)可疑癌和高分化癌細(xì)胞、反應(yīng)性間皮細(xì)胞和間皮瘤等較難鑒別診斷的疑難病例較難確診。雖然液基薄層細(xì)胞涂片也可以行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，但具有細(xì)胞陽(yáng)性區(qū)域不易確定，非特異性著色較多，所能標(biāo)記的抗體種類、數(shù)目有限等缺點(diǎn)。

圖2 同一細(xì)胞塊的免疫組化染色

細(xì)胞塊技術(shù)具有組織學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，可提高陽(yáng)性率；切片可以復(fù)制，資料容易保存，并可進(jìn)行多項(xiàng)檢查［6］。應(yīng)用細(xì)胞塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性部位明顯，色彩鮮艷，定位準(zhǔn)確，背景清晰，具有很高的可靠性及可重復(fù)性，對(duì)于鑒別良惡性胸腹水及判斷惡性腫瘤細(xì)胞來源具有重大的科學(xué)性及實(shí)用性［7］。筆者采用CK7、CK20、TTF－1、NapasinA、villin、CDX2、CEA、MC、CR、CD68等抗體進(jìn)行胸腹水細(xì)胞塊免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述10種抗體對(duì)肺、胃腸、胰腺、卵巢、乳腺等部位的組織起源的確診具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，與液基薄層細(xì)胞檢查比較，繼而進(jìn)行細(xì)胞塊免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)惡性腫瘤的確診率和可疑癌所占比例，差異有顯著性（P＜0．01）。液基薄層細(xì)胞檢查與細(xì)胞塊的免疫組織化學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高癌確診率和降低可疑癌的診斷率，且能確定大部分腫瘤細(xì)胞的類型和來源，更能為臨床提供可靠診斷依據(jù)。

總之，對(duì)常規(guī)胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)診斷有疑問的病例，進(jìn)行細(xì)胞塊及免疫組織化學(xué)檢測(cè)具有重要意義。將兩種方法相結(jié)合不僅可以在疑難胸腔積液和腹水鑒別診斷中起關(guān)鍵作用，還可鑒別惡性腫瘤細(xì)胞的類型和來源，為臨床的明確病因及進(jìn)一步治療提供了很重要的依據(jù)。

［1］Laucirica R，Bentz JS，Souers RJ，et al．Do liquidbased preparations of urinary cytology perform differently than classically prepared cases？observations from the college of American pathologists interlaboratory comparison program in non-gynecologic cytology［J］．Archi Pathol Laborat Med，2010，134（91）：19－22．

［2］Patricia AF，Aylin S，Keith B，et al．Comparison of three commonly used cytologic preparation in effusion immunocytochemistry［J］．Diagn Cytooathol，2002，26（1）：61－66．

［3］曹躍華，楊 敏，陳隆文，等．細(xì)胞病理學(xué)診斷圖譜及實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2009：410－412．

［4］毛瑛玉，楊 敏，劉冬戈，等．細(xì)胞塊切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色在漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用［J］．中華病理學(xué)雜志，2009，38（8）：547－550．

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［6］Nangia R，Sait SN，Block AW，et al．Trisomy 6 in basal cell carcinomas correlates with metastatic potential：a dual color fluorescence in situ hybridization study on paraffin sections［J］．Cancer，2001，91（10）：1927－1932．

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［2015-10-19收稿，2015-11-17修回］

［本文編輯：吳 蓉］

Liquidbased thin－cytologic test combined with cell block sections technology for diagnosing hydrothorax and ascites tumor

SHANG Fang-fang，ZHAO Hui，WANG Qiang，et al.
The Pathology Department of the 401st Hospital，Qingdao，Shandong 266071，China

ObjectiveTo evaluate the combined application of routine liquidbased thin－cytologic test and cell block sections in hydrothorax and ascites tumor cytodiagnosis．MethodsImmunohistochemical staining of cell block paraffin embedding cell block were carried out to determine the characteristics of tumor cells，as well their type and origin．Routine liquidbased thin－cytologic test was alone performed as a control．ResultsTotally 111 of 476 patients were diagnosed malignant，and 365 benign through paraffin embedding cell block and immunohistochemical staining，which was significantly better than alone routine liquidbased thin－cytologic test detection（310 benign lesions and 90 malignant tumors）（P＜0．01）；No statistically significant difference were found in tunor classification（104 cases）compared with TCT（77 cases）（P＞0．05）；Significantly difference was found in tumor origin（92 cases）compared with TCT（0 case）（P＜0．01）．ConclusionThe combined application of routine liquidbased thin－cytologic test and cell block sections from hydrothorax and ascites can provide valuable methods of tumor diagnosis and to distinguish the origins of tumor cell tissues．

Liquidbased thin－cytologic test；Pleuraleffusion；Ascites；Cellblock；Immunohistochemical staining

R730.43

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.006

266071山東青島，解放軍401醫(yī)院病理科（尚芳芳，趙輝，王強(qiáng)，種道臣）