QuEChERS/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中氯硝柳胺

劉伶俐,萬譯文,伍遠(yuǎn)安,索紋紋,肖 維

(1.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)沙),湖南長(zhǎng)沙 410153;2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,湖南長(zhǎng)沙 410153;3.水產(chǎn)健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南常德 415000)

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QuEChERS/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中氯硝柳胺

劉伶俐1,萬譯文2,*,伍遠(yuǎn)安3,索紋紋1,肖 維1

(1.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)沙),湖南長(zhǎng)沙 410153;2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,湖南長(zhǎng)沙 410153;3.水產(chǎn)健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南常德 415000)

本文建立了QuEChERS/液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測(cè)定水產(chǎn)品中氯硝柳胺殘留量的分析方法。樣品經(jīng)氨化乙腈提取,C18吸附劑與中性氧化鋁凈化后,采用HPLC-MS/MS選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)負(fù)離子模式測(cè)定進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果表明:在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi),峰面積與濃度線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.9996;氯硝柳胺檢出限(LOD)為0.2 μg/kg,定量限(LOQ)為0.4 μg/kg,檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.33%～9.91%(n=5),平均加標(biāo)回收率達(dá)到74.6%～92.1%。該方法具有較高的適用性和選擇性,在水產(chǎn)品中氯硝柳胺的殘留測(cè)定中具有很好的應(yīng)用前景。

氯硝柳胺,QuEChERS,液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法,水產(chǎn)品

氯硝柳胺(Niclosamide,NIC),又名殺螺胺,是一種有效的殺蟲劑,也是一種人工合成的殺螺藥物[1-2],可以有效的殺滅動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲和絳蟲,是世界衛(wèi)生組織自1972年來唯一推薦使用的滅螺藥,目前國家尚未有氯硝柳胺在食品中的限量要求,其主要用于防治血吸蟲[3]。由于該藥物對(duì)魚類有劇毒,會(huì)造成魚類的死亡[4-5],因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,漁民采用該藥物清塘,滅殺雜魚,由于效果顯著,在水產(chǎn)上逐步被推廣開來,因此在水產(chǎn)上的使用量越來越大。

目前國內(nèi)外已經(jīng)研制出的氯硝柳胺測(cè)定分析方法主要有生物測(cè)定法、滴定法、電化學(xué)分析法(electrochemical analysis)、紫外-可見分光光度法(UC)、液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法等[6-11]。目前應(yīng)用較多的色譜法中,由于氣相法與氣質(zhì)聯(lián)用法需要衍生化,來提高分析的敏感性,前處理步驟較為繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng)。而采用液相色譜法通過不同溶劑來選擇性分離氯硝柳胺,可得到較好的分離效果。采用液質(zhì)聯(lián)用法更適用于檢測(cè)極性化合物而不需要衍生,相對(duì)于液相色譜法而言,能進(jìn)一步降低了檢出限,提高靈敏度和選擇性,更適合于基底復(fù)雜的生物材料中氯硝柳胺的痕量檢測(cè)。

水產(chǎn)品成分較為復(fù)雜,基質(zhì)中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪以及色素等雜質(zhì),氯硝柳胺作為親脂性物質(zhì),與水產(chǎn)品的脂肪緊密結(jié)合。QuEChERS方法是一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、抗干擾、安全的樣品前處理方法,其原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用,吸附雜質(zhì)達(dá)到除雜凈化的目的[12-14]。本文通過采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品處理,通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的篩選和實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn),利用液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用來測(cè)定水產(chǎn)品中的氯硝柳胺,縮短了前處理時(shí)間,靈敏度高,能實(shí)現(xiàn)藥物殘留的快速檢測(cè),能滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關(guān)基礎(chǔ)研究的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)品 純度>98%,湖南省藥物研究所;甲醇 色譜純,德國Merck公司;乙腈 色譜純,德國Merck公司;乙酸乙酯 色譜純,德國Merck公司;C18吸附劑 70～230目,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;無水硫酸鎂 分析純,Adamas試劑公司;中性氧化鋁 分析純,Alfa Aesar天津化學(xué)有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682中一級(jí)水的規(guī)定。所用試劑除另有指定外,均為分析純。TSQ QUANTUM液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾公司;分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司,感量0.0001 g;高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;試管震蕩混勻器 美國,Fisher;步琪平行蒸發(fā)儀 瑞士buchi公司;氮?dú)獯祾邇x 美國Organomation公司。

1.2 樣品預(yù)處理

取樣品5.00 g(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中,加入10 mL氨化乙腈(pH9～10),在漩渦混合儀上充分混合2 min,超聲提取10 min,以6000 r/min離心10 min,取上清液于25 mL比色管中,殘?jiān)性俅渭尤?0 mL氨化乙腈(pH9～10),重復(fù)提取1次,合并2次提取液于25 mL比色管中,用乙腈定容至刻度。

取上述提取液5 mL于10 mL離心管中,置45 ℃氮吹至干,加入1 mL 90%乙腈水溶液渦旋溶解殘留物,將0.5 g C18吸附劑及0.2 g中性氧化鋁加入到離心管中,渦旋混勻,充分吸附樣品中的雜質(zhì)和色素,10000 r/min離心8 min,取上清液經(jīng)0.2 mm濾頭過濾至進(jìn)樣瓶中,HPLC-MS/MS測(cè)定。整個(gè)樣品處理過程要求避光。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定

精確稱取約5.0 mg氯硝柳胺于50 mL容量瓶中,用乙腈在超聲水浴中溶解,放冷,用乙腈定容,可得到0.1 mg/mL的氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

取氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇逐級(jí)稀釋成最終濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液系列;分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

1.4.1 色譜條件 Hypersil Gold柱(150 mm×2.1 mm,3 μm),柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相:80%乙腈+20%水,流量0.3 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用大氣壓電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式;噴霧電壓為-3000 V;離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃,Q1半峰寬為0.7Da;Q3半峰寬為0.7Da;碰撞氣氬氣壓力為1.5 mTorr;鞘氣流量為12 L/min;輔助氣流量為2 L/min;采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)。氯硝柳胺質(zhì)譜采集參數(shù)如表1。

表1 氯硝柳胺質(zhì)譜采集參數(shù)
Table 1 MS/MS acquisition parameters for Niclosamide

母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞能量(V)起始時(shí)間(min)結(jié)束時(shí)間(min)Tubelens32511352420805332511710300805332518928901908053

1.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中氯硝柳胺殘留量按公式(1)計(jì)算,計(jì)算結(jié)果需扣除空白值,結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

式(1)

式中:X-樣品中氯硝柳胺殘留量(μg/kg);C-樣品溶液中氯硝柳胺的測(cè)量濃度(μg/mL);V-樣品溶液最終定容體積(mL);m-樣品稱樣量(kg)。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

樣品的濃度值采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量得到,標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行計(jì)算和繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的組成對(duì)分離效果的影響

實(shí)驗(yàn)分別嘗試0.1%的甲酸水溶液和乙腈(V∶V=20∶80)、甲醇和0.1%的甲酸水溶液(V∶V=80∶20)、乙腈和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)、甲醇和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)以及乙腈和水(V∶V=80∶20)作流動(dòng)相,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在流動(dòng)相中無論加入酸或堿,均會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間嚴(yán)重漂移,出峰面積不穩(wěn)定。這可能與氯硝柳胺的性質(zhì)有關(guān),氯硝柳胺pKa值為7.3,是兩性化合物[15],因此無論是在酸性還是堿性條件下,均出現(xiàn)離子化不穩(wěn)定的情況。而乙腈和水作為流動(dòng)相時(shí)出峰峰形良好,且保留時(shí)間穩(wěn)定,最終確定為流動(dòng)相。

2.2 提取溶劑的選擇

常用的提取溶劑有甲醇、乙腈和乙酸乙酯等,本文比較了甲醇、氨化乙腈(pH9～10)和乙酸乙酯在提取水產(chǎn)品中氯硝柳胺上的不同,采用甲醇和氨化乙腈(pH9～10)作為提取劑時(shí),能較好的沉淀水產(chǎn)品中蛋白質(zhì),通過高速離心后容易去除,蛋白質(zhì)含量低，有利于下一步過程中QuEChERS凈化,而采用乙酸乙酯提取時(shí),對(duì)水產(chǎn)品中的雜質(zhì)提取較多,在氮吹時(shí)殘留雜質(zhì)不容易吹干,影響目標(biāo)物回收率。而乙腈與甲醇相比,乙腈的滲透性更強(qiáng),提取效果更佳,可使得氯硝柳胺的回收率更高,因此本文采用氨化乙腈作為目標(biāo)物的提取劑,是由于氯硝柳胺在堿性環(huán)境中更易溶解。

表1 氯硝柳胺線性范圍和檢出限
Table 1 The linear range and detection limit of Niclosamide

藥物線性范圍(μg/L)回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限(μg/kg)定量限(μg/kg)氯硝柳胺05～100Y=50244x+27890099960204

2.3 凈化方式的選擇

水產(chǎn)品常用的凈化方式有使用正己烷、固相萃取柱以及QuEChERS凈化。QuEChERS采用的是分散型固相萃取進(jìn)行凈化,常用的吸附劑有C18、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)、弗羅里硅土、中性氧化鋁及石墨化炭黑(GCB)。吸附劑的選擇和用量主要根據(jù)不同的樣品基質(zhì)來決定,考慮到水產(chǎn)品含有大量的脂肪及蛋白質(zhì)且氯硝柳胺為兩性化合物,本文選擇C18、中性氧化鋁的組合作為吸附劑,這是由于C18和中性氧化鋁均為常用的吸附劑,常用于非極性到中等極性物質(zhì)的吸附,具有良好的除脂能力。結(jié)果表明:當(dāng)采用0.5 gC18吸附劑及0.2 g中性氧化鋁作為分散型固相萃取吸附劑時(shí),溶液清亮,基質(zhì)干擾小。該方法可提高實(shí)驗(yàn)效率,降低成本,還有效地提高了回收率。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)特征,實(shí)驗(yàn)選用電噴霧ESI負(fù)離子電離模式,以流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣(1.0 mg/L)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描,掃描范圍在200～400之間,得到一級(jí)質(zhì)譜圖和分子離子([M-H]-)峰為母離子,將該母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,找出豐度最強(qiáng)的碎片離子為定量離子,豐度次強(qiáng)的碎片離子為定性離子。在此基礎(chǔ)上對(duì)錐孔電壓、碰撞能量及離子源溫度進(jìn)行優(yōu)化,使其分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度最大時(shí)為最佳,用于后續(xù)的定性及定量工作。得到1.4.2中最佳質(zhì)譜條件。

在“1.4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件”下對(duì)氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,得到了比較理想的色譜峰,峰形尖銳且對(duì)稱性好,增大了分子離子峰的峰強(qiáng)度,氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖1。

圖1 氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 SRM chromatogram of Niclosamide(10 ng/mL)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將配制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件下進(jìn)行測(cè)定,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,氯硝柳胺濃度在0.5～100 μg/L范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。在魚、蝦、蟹等陰性樣品中添加氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平為0.2 μg/kg)經(jīng)測(cè)定信噪比(S/N)均大于3,表明該物質(zhì)的檢測(cè)下限(LOD)為0.2 μg/kg,在魚、蝦、蟹等陰性樣品中添加氯硝柳胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平為0.4 μg/kg)經(jīng)測(cè)定信噪比(S/N)均大于10,表明其定量下限(LOQ)可為0.4 μg/kg。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表1。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度

采用在草魚、對(duì)蝦及中華鱉陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法,在1.0、2.0、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度水平重復(fù)5次,方法回收率與精密度數(shù)據(jù)列于表2。由表2中可見,氯硝柳胺平均回收率在74.6%～92.1%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.33%～9.91%之間,說明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 空白樣品中氯硝柳胺加標(biāo)回收率及精密度(n=5)
Table 2 Fortified recoveries and precision of Niclosamide in blank samples

藥物添加濃度(μg/kg)平均回收率(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)氯硝柳胺1074686220883991100921433

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

運(yùn)用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)中的20個(gè)水產(chǎn)品樣品進(jìn)行了分析檢測(cè),樣品均未檢出氯硝柳胺。結(jié)果表明:該方便簡(jiǎn)單、快速,具有很好的適用性和可操作性,譜圖無干擾。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中氯硝柳胺含量的檢測(cè)方法。該法具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),能滿足水產(chǎn)品中氯硝柳胺殘留監(jiān)控的要求,可為氯硝柳胺在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段,對(duì)食品的安全工作提供了有力的保障。

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Simultaneous determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Ling-li1,WAN Yi-wen2,*,WU Yuan-an3,SUO Wen-wen1,XIAO Wei1

(1.Fishery Products Quality Supervision and Testing Center,Ministry of Agriculture,Changsha 410153,China; (2.Hunan Fisheries Science Institute,Changsha 410153,China; (3.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China)

To establish an analytical method for the determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry,the sample was extracted with acetonitril,the extract was cleaned up with C18and Alumina-N,the mass spectrometer was operated in the negative ion mode using selected reaction monitoring for the qualitative and quantitative analysis. The linear ranges were from 0.5 to 100 ng/mL with a good linear relationship(R2=0.9996). The detection limits of this method for niclosamide residues were 0.2 μg/kg,and the limits of quantification were 0.4 μg/kg. The relative standard deviations ranging from 4.33%～9.91%(n=5)and the average recovery rates were from74.6%～92.1%. The method proposed by this paper possessed higher applicability and selectivity. It is promising in real applications of determining the niclosamide residues in aquatic products.

niclosamide;QuEChERS;liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry;aquatic products

2015-12-16

劉伶俐(1981-)，女，碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量與環(huán)境分析化學(xué)工作，E-mail:25646858@qq.com。

*通訊作者:萬譯文(1984-)，男，碩士，講師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全和漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)，E-mail：cnjs3385@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)23-0316-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.050