溫泉水中嗜肺軍團菌污染調查及分子分型研究

章樂怡,李 毅,上官智慧,吳躍進,謝愛蓉,王良懷,陳文斌

溫泉水中嗜肺軍團菌污染調查及分子分型研究

章樂怡1,李 毅1,上官智慧1,吳躍進1,謝愛蓉1,王良懷1,陳文斌2

目的 探討溫泉水環(huán)境中嗜肺軍團菌的污染狀況和分布規(guī)律，了解其主要血清型別及基因型別。方法采取隨機抽樣方法采集溫泉場所蓄水池、溫泉池、客房淋浴水等，濃縮后用細菌培養(yǎng)法分離得到可疑菌株，用血清學與熒光定量 PCR技術進行嗜肺軍團菌的鑒定。對分離的菌株用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點序列分型方法(SBT)進行基因分型。結果65份溫泉水中35份檢出嗜肺軍團菌，檢出率為53.85%。嗜肺軍團菌計數(shù)范圍在20 CFU/100 mL-16 000 CFU/100 mL之間。血清分型以LP1、LP3為主。分離的嗜肺軍團菌菌株均攜帶dot基因。對40株嗜肺軍團菌菌株進行了PFGE聚類分析，得到10種不同的帶型。40株菌株13種ST型可以被分為3個克隆群和1個單態(tài)群。結論本地區(qū)溫泉水嗜肺軍團菌污染程度較高，分子分型結果表明這些菌株具有遺傳多樣性。

溫泉水；嗜肺軍團菌；分子分型；遺傳多樣性

Supported by the Science and Technology Development Program of Wenzhou City(No.Y20150311)

軍團菌(Legionella)是一種革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然環(huán)境和人工環(huán)境的水體、土壤中。軍團菌病是由軍團菌引起的一種以肺炎為主的全身性疾病。嗜肺軍團菌是導致軍團病最主要的病原體。人類對軍團菌普遍易感，人感染軍團菌主要是通過吸入被軍團菌污染的氣溶膠而導致[1]。我國于1982年在南京首次發(fā)現(xiàn)軍團菌病病例，全國已有多起軍團病的散發(fā)與暴發(fā)、流行報道[2-4]。

近年來國外溫泉水引起的軍團菌暴發(fā)事件時有報道，旅游獲得型疫情中，以源于溫泉與水療的比例最高。歐洲軍團菌感染工作組(EWGLI)2007—2008 年間報告軍團菌疫情中，其中 6 起與噴泉和水療有關[5]。日本也有相關文獻報道軍團菌病例發(fā)生與溫泉水有關[6]。

國內(nèi)陸續(xù)有來自各地對環(huán)境樣本軍團菌監(jiān)測報道，大多是來自集中空調冷卻塔水、冷凝水的調查[7-8]，也有淋浴水、管道水、溫泉水、花卉培育土等軍團菌污染調查[9-10]。環(huán)境監(jiān)測結果表明軍團菌已成為人們?nèi)粘Ｉ钪型{健康的重要因素。在溫州地區(qū)，對于冷卻塔水監(jiān)測是從2009年開始的，但是對于溫泉水系統(tǒng)的監(jiān)測處于空白。溫泉風景區(qū)是我市的旅游勝地，近些年溫泉文化主題景區(qū)的開發(fā)力度較大, 吸引不少省內(nèi)外游客。因此為保證游客健康，在本地區(qū)進行溫泉水環(huán)境軍團菌污染調查是有必要的。我們選取本市溫泉景區(qū)4個溫泉場所作為監(jiān)測點，進行嗜肺軍團菌的調查和研究, 對分離出來的菌株用脈沖腸凝膠電泳(PFGE)和多位點序列分析(SBT)進行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1樣本采集 采集本市溫泉風景區(qū) 4家溫泉場所(包括溫泉酒店和度假村)的溫泉水，在正常營業(yè)期間于每個場所采水樣，分別在2015年8月、2016年1月、2016年6月3個時間段進行，前兩次采樣，每次每家場所隨機選取5個點，包括各個溫泉池水和房間淋浴噴頭的溫泉水。2016年6月除采集溫泉池水和房間淋浴噴頭的溫泉水外，增加采集溫泉泉眼水、各個溫泉場所的蓄水池水，以滅菌廣口瓶采集水樣500 mL，并記錄水溫，水樣加硫代硫酸鈉中和余氯，當日送達實驗室進行檢測。

1.2軍團菌分離 參照文獻[11]進行軍團菌分離，取200 mL水樣，用孔徑0.45 μm 濾膜經(jīng)抽濾系統(tǒng)集菌后進行酸處理，取0.1 mL 處理過的樣品接種于GVPC平板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育10 d，逐日觀察結果，挑取可疑菌落做初步鑒定。在 BCYE 平板上生長而在BCYE-cye 平板及血瓊脂平板上不生長的初步認定為軍團菌，疑似菌落再進行血清學凝集試驗。

1.3熒光定量PCR方法 參照文獻[12-14]的引物和探針，針對軍團菌屬5S rRNA 基因和嗜肺軍團菌dot基因保守序列，5S rRNA 探針5′端標記HEX，3′端標記BHQ；dot基因探針5′端標記FAM，3′端標記MGB。通過檢測這2種基因進一步進行菌株復核鑒定。

1.5SBT分型 利用7個基因測序對軍團菌進行SBT分型。選用7種管家基因合成7對引物，選擇嗜肺軍團菌的7個基因(flaA,pilE,asd,mip,mompS,proAandneuA)作為本研究的目的基因。等位基因的選擇參照EWGLI網(wǎng)站發(fā)布的嗜肺軍團菌SBT 標準方法(5.0版本)http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php。運用BioNumerics version 7.5 對所得嗜肺軍團菌ST型別進行聚類分析，分析其遺傳關系。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以率、構成比為主要指標，率的差異比較用χ2檢驗，P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1溫泉水中嗜肺軍團菌檢出情況 共檢測溫泉水65份，35 份檢出，檢出率為53.85%；夏季檢出率為51.11%(23/45)，冬季檢出率為60%(12/20)，夏季、冬季檢出率無統(tǒng)計學差異，(χ2=0.44，P>0.05)。嗜肺軍團菌計數(shù)從在 20 CFU/100 mL～16 000 CFU/100 mL之間。其中軍團菌含量為10～100 CFU/100 mL)者有18份標本 ，軍團菌含量為100～1 000 CFU/100 mL者有 11 份標本 ，軍團菌含量1 000～10 000 CFU/100 mL者有4份標本，2份標本軍團菌含量>10 000 CFU/100 mL。溫泉泉眼沒有檢出嗜肺軍團菌，溫泉池、蓄水池、房間淋浴噴頭的溫泉水檢出率分別是83.33%、42.86%、36.36%。(χ2=12.814，P<0.05)見表1。

表1 溫泉場所不同溫泉點溫泉水嗜肺軍團菌檢出情況

Tab.1 Contamination status of hot spring water from different collecting points

采集地點Samplinglocation陽性率(%)Positiverate(%)蓄水池watertank42．86(3/7)溫泉池hotspringpool83．33(20/24)淋浴噴頭shower36．36(12/33)泉眼spring0(0/1)合計Total53．85%(35/65)

2.2嗜肺軍團菌血清型分布情況 從35份軍團菌陽性的水體中共檢出40株嗜肺軍團菌菌株(有5份水樣分別檢出2個型別的嗜肺軍團菌)。其中包含LP1、LP2、LP3、LP13等4種血清型，LP1占檢出菌的37.50%(15/40)、LP3 為45.00%(18/40)，LP2為12.50 %(5/40)，LP13為 5.00%(2/40)。

2.3熒光定量PCR結果 利用軍團菌5S rRNA基因和嗜肺軍團菌dot基因的引物，對40株檢出的軍團菌菌株進行 PCR 擴增，結果40株軍團菌5S rRNA、dot基因均為陽性，陽性率為100.00%，5S rRNA是軍團菌屬共有基因,高度保守，dot基因來區(qū)別嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌，dot基因作為嗜肺軍團菌一種毒力島基因，與毒力有關，結果證明40株菌株均為嗜肺軍團菌。

2.4PFGE結果 對40株分離株進行了PFGE分型，獲得10種不同的帶型，以 LPA16.CN0142 帶型最常見，共13株。溫泉水中帶型一致的有來自不同的溫泉場所，且同一溫泉中有多種帶型。見圖1。

A代表溫泉池，B代表客房淋浴噴頭，C代表蓄水池，HW1-4表示4個溫泉場所A：hot spring pool, B：shower room, C：water tank, HW1-4 four hot springs environments圖1 2015-2016年溫泉場所中分離出的40株嗜肺軍團菌PFGE聚類結果 Fig.1 Clustering results of patterns obtained by PFGE analysis of 40 Legionella strains from hot springs in 2015-2016

2.5SBT分型結果 通過BioNumerics 聚類分析， 40株嗜肺軍團菌菌株ST型被分為 3 個克隆群和 1個單態(tài)群，其中克隆群1 包含 8種ST 型，克隆群2、3 均包括2種ST型。40株菌株分為13種ST型，分別有ST 87、1226、1230、1469，1101等。幾種嗜肺軍團菌血清型的 ST型別：15株LP1血清型軍團菌被分為7種 ST型，11株LP3 血清型被分為5種ST型，5株LP2血清型分5種ST型。溫泉水中發(fā)現(xiàn)幾種新的ST型，與本地區(qū)其他水中分離菌株相比，溫泉水分離菌株具有更高的多態(tài)性，其中ST87比較常見，在3個溫泉中都發(fā)現(xiàn)。見表2、圖2。

表2 溫泉水中不同血清型嗜肺軍團菌的克隆群分布

Tab.2 Distribution of clonal groups from 40 SBT profiles for different serotypes of L. pneumpphila isolated in springs

Clonalgroups(CGs)STsserogroupsflaApilEasdmipmompsproAneuANo．ofisolatesCGl(n=21)1469LP3261739111131101LP1661539141122196LP1，LP2，LP13661534141142198LP2610157174312201LP11761539141112203LP1，LP36615394362204LP1，LP366153441332205LP217101571714111CG2(n=14)87LP321032894138961LP1，LP3210328914116CG3(n=2)2197LP235171411812199LP27517143281Singleton(n=3)2202LP12101714211483

最小生成樹的圓圈表示序列類型，每個圓圈的大小表示在這個ST型別的分離株數(shù)量, ST周圍的光環(huán)的顏色表示同一克隆復合物群。

In the minimum spanning tree, the sequence types (STs) are displayed as circles. The size of each circle indicates the number of isolates within this particular type, the colors of halo surrounding the STs denote types that belong to the same clonal group.

圖2 溫泉水中40株嗜肺軍團菌最小生成樹圖

Fig.2 Minimum spanning tree analysis of 40Legionellaisolated from spring water

3 討 論

本研究表明本市溫泉水嗜肺軍團菌檢出情況不容樂觀，分別于3個時間段進行采樣，前兩次是隨機采取各溫泉場所的溫泉池及房間淋浴噴頭溫泉水。檢測結果表明嗜肺軍團菌檢出率一直居高不下，最后一次進行污染源的調查，從溫泉泉眼著手，采集泉眼水、每個溫泉場所的蓄水池、溫泉池及房間的淋浴噴頭溫泉水。4個溫泉場所溫泉水來自同一溫泉泉眼，結果表明溫泉泉眼水未檢出嗜肺軍團菌，3個溫泉場所的蓄水池均檢出嗜肺軍團菌，而溫泉池及客房淋浴的溫泉水都是分別從各場所蓄水池通過管道流入的。溫泉池及客房淋浴水檢出的嗜肺軍團菌的血清型別較蓄水池多，部分檢出和蓄水池相同的型別。蓄水池中均只檢出一種型別的嗜肺軍團菌，不排除其他血清型漏檢的可能，部分溫泉池中檢出兩種以上的嗜肺軍團菌，這和別的文獻中報道也是相符的[10]。溫泉水檢出的嗜肺軍團菌中以LP1型和LP3型為多，LP1和LP3型是引起軍團菌病的兩個主要的血清型。

溫泉水嗜肺軍團菌計數(shù)表明有6份溫泉水嗜肺軍團菌計數(shù)超過1 000 CFU/100 mL ，其中2份高于10 000 CFU/100 mL。根據(jù)文獻，在歐洲一些國家，當水體中嗜肺軍團菌數(shù)量>100 CFU/100 mL時，就必須對這種水體進行消毒處理[17]。雖然到目前為止，對軍團菌感染劑量還沒有精確的定義，但數(shù)據(jù)表明，在軍團菌水污染達102-104CFU/100 mL時，可能會導致散發(fā)病例，當數(shù)值超過104CFU /100 mL可能會引起軍團菌暴發(fā)[18-20]。而我們的溫泉水計數(shù)最高的2份水樣中的嗜肺軍團菌幾乎到達文獻中軍團菌病暴發(fā)的一個值。雖然目前在中國2011年旅游行業(yè)標準《溫泉企業(yè)服務質量等級劃分與評定》LB/T 016-2011[21]里規(guī)定溫泉水不得檢出嗜肺軍團菌，但沒有定量限值，且沒有標準檢驗方法，表明溫泉水行業(yè)標準有待進一步完善。

PFGE結果表明，幾個溫泉場所的的溫泉水各自的軍團菌PFGE帶型多樣化，但大多數(shù)菌株相似度達87.0%以上，同一溫泉場所中不同地點的溫泉水有幾種帶型存在。溫泉場所1的蓄水池與溫泉池中菌株血清型不同，但PFGE分析菌株相似度達 94.1%；溫泉場所3的蓄水池與部分房間淋浴水、溫泉池檢出的菌株帶型一致，但部分血清型不一致；溫泉場所4的蓄水池與部分溫泉池檢出的菌株帶型一致。說明這些菌株是相關聯(lián)的。由于溫泉蓄水池沒定期清洗，嗜肺軍團菌一直在池水中存活，并流到了各個溫泉池，而在不同的環(huán)境中，部分菌株某些位點發(fā)生了變異。溫泉場所2中的蓄水池沒有檢出，但在不同的房間淋浴噴頭水里檢出嗜肺軍團菌，各個點分離出的菌株，有完全一致的帶型，也有相似值較低的。故PFGE分型進一步證實各場所溫泉水嗜肺軍團菌污染的環(huán)節(jié)是不同的。除了蓄水池這個污染環(huán)節(jié)外，還存在某些溫泉池或淋浴管道本身污染的可能。而單純的血清分型不能說明軍團菌污染來源。

溫度被認為是主要影響軍團菌污染的因素[22]。我們在每份水樣采樣時均做了水溫記錄，發(fā)現(xiàn)4個溫泉點的水溫在32 ℃～41 ℃，正是嗜肺軍團菌繁殖和存活的適宜溫度。文獻報道，通常嗜肺軍團菌的最適生長溫度在35 ℃和46 ℃之間[23]。

嗜肺軍團菌 SBT分型結果表明本地區(qū)溫泉水中的嗜肺軍團菌具有遺傳多樣性，共分為13種ST型。分離到9種新的ST型(ST2196-2205)，是歐洲數(shù)據(jù)庫中沒有的ST型，成為目前本地區(qū)嗜肺軍團菌的特有型別，另4個ST型(ST87，ST7、ST114、ST9)以前均在世界多個國家引起軍團菌病，特別需關注ST87，在3個溫泉場所均發(fā)現(xiàn)，血清型為LP3，與歐洲軍團菌數(shù)據(jù)庫中提交的臨床株血清型一致。溫泉水菌株中沒有發(fā)現(xiàn)ST1型，而本地區(qū)歷年冷卻塔水中檢出的 ST型以ST1型為主，且血清型均是LP1[24]。故遺傳進化分析表明本地區(qū)溫泉水中嗜肺軍團菌的遺傳特征有別于冷卻水中的嗜肺軍團菌。

結果表明溫泉水嗜肺軍團菌污染程度較高，有個別點已達到一個高風險的值，故對人群的健康存在潛在風險，為保護廣大旅游者的健康，預防和控制本市軍團菌病的發(fā)生，應該對這些溫泉度假村進行必要的干預。

調查研究結果向衛(wèi)生部門提交后，相關部門對溫泉場所進行了專項整治，規(guī)范溫泉的衛(wèi)生管理，進行徹底清洗消毒，并制定日常消毒管理制度。

(此項研究得到中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所秦天老師、周海健老師、任紅宇老師等幾位專家的大力支持和幫助，在此一并致謝！)

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Contamination status and molecular typing ofLegionellapneumophilain spring environments

ZHANG Le-yi1, Li Yi1, SHANGGUAN Zhi-hui1, WU Yue-jin1,XIE Ai-rong1, WANG Liang-huai1, CHEN Wen-bin2

(1.WenzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325000,China；2.TaishunCenterforDiseaseControlandPrevention,Taishun325500,China)

To research the contamination status and distributive regulation ofLegionellapneumophilain samples from spring water and analyze the main serotypes and genotypes of the pathogen, a stratified sampling method was adopted to collect water samples randomly from water tank, hot spring pool, shower room of hot spring recreations. Suspected strains were isolated from condensed water samples. Serum agglutination assay and real-time PCR technology were used to identifyL.pneumophila. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and sequence-based typing (SBT) were used to describe the genetic polymorphism of the isolates. Overall, 53.85% of water samples showedLegionella-positive, and their concentrations ranged from 20 CFU/100 mL to 16 000 CFU/100 mL. The main serotypes were LP1 type and LP3 type and all strains carrieddotgene. Among them, 40 isolates were analyzed by PFGE by which 10 distinct patterns were differentiated. They were also selected for SBT analysis and divided into 13 different sequence types in 3 main clonal groups belonging to one homomorphic type. Our results demonstrated high prevalence and genetic polymorphism ofLegionellain hot spring recreations of Wenzhou. Hot spring area posed a potential threat to tourists. Spring water of these places should be intervened to prevent occurrence ofLegionnaires' disease.

spring water;Legionellapneumophila; molecular typing; genetic diversity

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.010

1.溫州市疾病預防控制中心，溫州 325000； 2.泰順縣疾病預防控制中心，泰順 325500

R378

A

1002-2694(2016)12-1096-06

2016-08-16；

2016-10-28

溫州市科技計劃項目(No.Y20150311)資助