布魯氏菌非編碼小RNA BSR1526突變株與過表達(dá)株的構(gòu)建及毒力研究

徐曉陽，歐紅萍，彭廣能，雷霜霜，田一男，曹雪峰，王玉飛，嚴(yán)光文，鐘志軍

布魯氏菌非編碼小RNA BSR1526突變株與過表達(dá)株的構(gòu)建及毒力研究

徐曉陽1，歐紅萍2，彭廣能1，雷霜霜1，田一男1，曹雪峰1，王玉飛3，嚴(yán)光文4，鐘志軍1

目的 為探討非編碼小RNA BSR1526在布魯氏菌胞內(nèi)生存中的作用，構(gòu)建BSR1526突變株與過表達(dá)株并分析它們?cè)谀M胞內(nèi)環(huán)境和小鼠體內(nèi)的存活能力。方法首先采用Northern blot和RT-PCR驗(yàn)證布魯氏菌16M在體外刺激條件中BSR1526的轉(zhuǎn)錄；然后采用融合PCR構(gòu)建BSR1526缺失株；將BSR1526插入到質(zhì)粒pBBR1-MCS4中，電轉(zhuǎn)入16M中構(gòu)建過表達(dá)株16M-BSR1526；最后分析BSR1526缺失株和過表達(dá)株在模擬胞內(nèi)環(huán)境以及小鼠體內(nèi)的存活力。結(jié)果BSR1526在布魯氏菌16M中存在轉(zhuǎn)錄，且在不同刺激條件下轉(zhuǎn)錄水平不同。BSR1526缺失或過表達(dá)影響了布魯氏菌16M在體外的生長能力，缺失后在熱應(yīng)激、氧化壓力及酸性環(huán)境下的生存能力下降，在小鼠脾臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量顯著下降，表明BSR1526影響了布魯氏菌的毒力。結(jié)論非編碼小RNA BSR1526影響著布魯氏菌16M在胞內(nèi)生存能力，缺失BSR1526后布魯氏菌16M抵抗外界不良環(huán)境的能力下降，同時(shí)在小鼠體內(nèi)的毒力下降。

布魯氏菌；非編碼小RNA；BSR1526；胞內(nèi)生存

細(xì)菌非編碼小RNA(Small non-coding RNA，sRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類RNA調(diào)控子，不編碼蛋白質(zhì)，長度在50～500個(gè)核苷酸之間[1]。過去它們被認(rèn)為是“垃圾RNA”，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)RNA的突變或異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。sRNA廣泛參與了生物生命活動(dòng)的調(diào)控[2]。目前認(rèn)為，細(xì)菌sRNAs 在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用，是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力、毒力以及代謝的重要調(diào)控子。sRNA廣泛參與細(xì)菌多種生命活動(dòng)的調(diào)控，如影響外膜平衡、新陳代謝、翻譯以及群體感應(yīng)和某些致病菌的毒力等[3-7]。

布魯氏菌屬于變形菌的α-2亞家族，無質(zhì)粒，僅有2條染色體即Ⅰ號(hào)和Ⅱ號(hào)染色體[8-9]。布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于宿主單核細(xì)胞內(nèi)(主要為巨噬細(xì)胞)，胞內(nèi)生存繁殖是其致病的關(guān)鍵。適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境，如營養(yǎng)缺乏、酸性環(huán)境及氧化壓力等，是布魯氏菌實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)生存的前提。目前，布魯氏菌中許多與胞內(nèi)運(yùn)輸和增殖相關(guān)的基因已被鑒定，然而調(diào)控這些基因協(xié)調(diào)表達(dá)促使布魯氏菌適應(yīng)宿主體內(nèi)惡劣環(huán)境的主要機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力的重要調(diào)控子sRNAs 在細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境機(jī)制中起著重要作用。每種環(huán)境因素至少與一種sRNA 相關(guān)聯(lián)，sRNA 將環(huán)境改變信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)菌胞內(nèi)有關(guān)基因，并引起一系列的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[10]。因此，尋找布魯氏菌中的sRNA，研究他們的功能和調(diào)控機(jī)制將有助于深入理解布魯氏菌的胞內(nèi)繁殖和致病機(jī)制。前期對(duì)羊種布魯氏菌16M研究中，我們測(cè)序預(yù)測(cè)了1 321個(gè)sRNA，其中BSR1526就是其中之一[11]。本研究對(duì)BSR1526進(jìn)行了Northern blot 及RT-PCR驗(yàn)證，確定其在16M中存在轉(zhuǎn)錄，并且可能參與布魯氏菌胞內(nèi)生存調(diào)控。因此，我們構(gòu)建了BSR1526的突變株和過表達(dá)株，進(jìn)一步研究BSR1526對(duì)布魯氏菌胞內(nèi)存活能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 羊種布魯氏菌(B.melitensis, 16M)為本室保存；大腸桿菌DH5α購自康為公司；pMD18-T Vector購自TaKaRa公司； pBBR1-MCS4(AmpR)為能在布魯氏菌中復(fù)制的質(zhì)粒，由Kenneth M. Peterson博士饋贈(zèng)[12]；布魯氏菌培養(yǎng)的大豆胰蛋白胨瓊脂(TSA)和大豆胰蛋白胨肉湯(TSB)購自生物梅里埃公司；LB用于大腸桿菌的培養(yǎng)；GEM(MgSO4.7H2O 0.2 g/L, Citric acid. H2O 2.0 g/L, K2HPO410.0g/L, NaNH4HPO4.4H2O 3.5 g/L, Glucose 20 g/L)培養(yǎng)基為營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基。

隨機(jī)引物、dNTP、DNA分子量Marker、高保真酶購自Takara公司；快速小提質(zhì)粒盒、Taq酶及XhoI和SpeI限制性核酸內(nèi)切酶購自康為公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNase I、RNasin@核糖核酸酶抑制劑和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；MasterPure RNA Purification Kit購自Epicentre；MICROBExpress bacterial mRNA enrichment Kit購自Ambion；Trizol 購自Invitrogen；0.1% Triton X-100購自Sigma；DIG Northern Starter Kit購自Roche；紫外可見光分光光度計(jì)ND-1000；GeneAmp○R PCR System 9700；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀。

SPF級(jí)6～8周齡BALB/c雌性小鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 引物 GenBank中下載B.melitensis16M相關(guān)基因序列，Primer Premier 5 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 BSR1526的預(yù)測(cè) 16M于100 mL TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期，采用MasterPureTM RNA Purification Kit提取總RNA，DNase消化殘存的DNA后用MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit從總RNA中去除rRNA，純化的mRNA通過Agilent生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。然后構(gòu)建cDNA測(cè)序文庫[13]，采用IlluminaHiSeq2000測(cè)序儀對(duì)文庫進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并預(yù)測(cè)sRNA[14]。BSR1526為眾多sRNA之一[11]，本試驗(yàn)圍繞該sRNA進(jìn)行研究。

1.4 Northern blot驗(yàn)證BSR1526 參照Beckmann的方法，使用DIG Northern Starter Kit進(jìn)行Northern blot[15]。

表1 引物序列

Tab.1 Primers used in this study

引物名稱(Primers)5′—3′序列(5′—3′sequence)SI1526-p?FCGAAAAGGCACCCCAAGCATGSI1526?p?RTAATACGACTCACTAT?AGGGGGTGGTCGATTTCTGCAT?CAGSI1526?RT?FCACGAAGCCTTCAAATTGSI1526?RT?RGGTCGATTTCTGCATCAGSI1526?N?FGTCACATTCTGCAATTCATGSI1526?N?RGACATTCATCCCAGGTGGCAT?GCTTGGGGTGCCTTTTCGSI1526?C?FTCTGGGGTTCGAAATGACCGAT?CAATTGACACGGCTGATGSI1526?C?RTCAAGATGATGGTCGATGTCSI1526?I?FTCAACAGCCGGTCCATGTCCSI1526?I?RCTATGAGGGCGATGGCCATGSI1526?FCTCGAGCGAAAAGGCAC?CCCAAGCATGSI1526?RACTAGTGGTGGTCGATTTCTG?CATCAG

1.5 不同刺激條件下BSR1526的RT-PCR鑒定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。對(duì)不同刺激條件下(PH=7.0的TSB、pH=4.0的TSB、pH=7.0營養(yǎng)缺乏GEM培養(yǎng)基和1.5 mmol/L的H2O2培養(yǎng)基)，BSR1526的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 缺失株和過表達(dá)株的構(gòu)建 缺失株采用抗性基因替換和融合PCR構(gòu)建突變株，具體參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。構(gòu)建正確后缺失突變株命名為16M-△BSR1526。過表達(dá)株構(gòu)建時(shí)，以SI1526-F和SI1526-R為引物擴(kuò)增目的片段。目的片段與pBBR1-MCS4質(zhì)粒經(jīng)XhoI和SpeI雙酶切。然后用T4 DNA Ligase將兩種酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化，篩選抗性單克隆菌進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確后測(cè)序(測(cè)序結(jié)果略)。鑒定正確者即為陽性克隆，命名為16M-BSR1526。

1.7 BSR1526突變株和過表達(dá)株的RT-PCR驗(yàn)證 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。采用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，SI1526-RT-F/SI1526-RT-R為引物，擴(kuò)增BSR1526片段，以16S rRNA為內(nèi)參進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.8 16M、16M-△BSR1526 和16M-BSR1526的生長曲線、體外應(yīng)激實(shí)驗(yàn)和小鼠毒力實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。小鼠毒力實(shí)驗(yàn)的接種劑量為1×105CFU/只，接種后7 d、14 d、28 d、45 d后處死小鼠，計(jì)算小鼠脾臟內(nèi)載菌數(shù)。

1.9 BSR1526靶基因的預(yù)測(cè) 利用TargetRNA2預(yù)測(cè)BSR1526的靶標(biāo)基因。進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)時(shí)，對(duì)候選sRNA和mRNA序列進(jìn)行計(jì)分，分?jǐn)?shù)為極值分布，判斷標(biāo)準(zhǔn)為P值，P值越小則相應(yīng)mRNA越有可能是其靶標(biāo)基因。TargetRNA2在線網(wǎng)址(http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/)。最后，查閱候選靶標(biāo)mRNA分子的相關(guān)功能。

1.10 小鼠毒力實(shí)驗(yàn) 6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，腹腔注射分別接種16M、16M-△BSR1526、16M-BSR1526和空白對(duì)照組(PBS)。劑量為1×105CFU/只。接種后7 d、14 d、28 d、45 d，各組取3只小鼠處死，無菌條件下取小鼠脾臟，稱重后放入1 mL 0.1% Triton X-100的生理鹽水中勻漿，組織勻漿液進(jìn)行倍比稀釋，選取適當(dāng)稀釋度的勻漿液100 μL涂板計(jì)數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算平均值。

1.11 BSR1526靶基因的預(yù)測(cè) 利用TargetRNA2預(yù)測(cè)BSR1526的靶標(biāo)基因。進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)時(shí)，對(duì)候選sRNA和mRNA序列進(jìn)行計(jì)分，分?jǐn)?shù)為極值分布，判斷標(biāo)準(zhǔn)為P值，P值越小則相應(yīng)mRNA越有可能是其靶標(biāo)基因。TargetRNA2在線網(wǎng)址(http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/)。最后，查閱候選靶標(biāo)mRNA分子的相關(guān)功能。

2 結(jié) 果

2.1 BSR1526的預(yù)測(cè) 經(jīng)高通量測(cè)序我們預(yù)測(cè)了眾多sRNA，其中BSR1526為候選sRNA之一。如圖1，BSR1526位于布魯氏菌Ⅰ號(hào)染色體BMEI1526和BMEI1533之間基因間區(qū)的正義鏈上，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為1 577 556，終點(diǎn)為1 577 730，長175 nt。

圖1 預(yù)測(cè)的BSR1526在染色體中的位置Fig.1 Location of BSR1526 on the B. melitensis 16M chromosome

2.2 Northern blot驗(yàn)證 為驗(yàn)證預(yù)測(cè)的BSR1526是否在16M中存在轉(zhuǎn)錄，提取標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下16M的總RNA，采用Northern blot進(jìn)行驗(yàn)證。如圖2所示， BSR1526在16M的總RNA中存在轉(zhuǎn)錄。

圖2 Northern blot驗(yàn)證BSR1526Fig.2 Verification of candidate sRNA BSR1526 by Northern blot

2.3 不同刺激條件下BSR1526的RT-PCR鑒定 結(jié)果表明，BSR1526在總 RNA中存在轉(zhuǎn)錄，且在不同刺激條件下其轉(zhuǎn)錄水平存在差異(圖3)。酸性條件下BSR1526的轉(zhuǎn)錄水平高于其他刺激條件。由于選用的條件為模擬的巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，BSR1526在這些條件下的轉(zhuǎn)錄存在差異，提示BSR1526參與了布魯氏菌的胞內(nèi)生存。

T7: TSB7.0; T4: TSB4.0; G: GEM7.0; H: H2O2.圖3 BSR1526的RT-PCR驗(yàn)證Fig.3 Verification of candidate sRNA BSR1526 by RT-PCR

2.4 BSR1526缺失株和過表達(dá)株構(gòu)建

2.4.1 缺失株構(gòu)建 SI1526-N-F和SI1526-N-R為引物擴(kuò)增出大小為530 bp的N端同源臂；以SI1526-C-F和SI1526-C-R為引物擴(kuò)增出大小為638 bp的C端同源臂；以pUC19K為模板，Kana-F和Kana-R為引物，擴(kuò)增出大小為1 093 bp的Kana基因；將3個(gè)片段融合成約2 000 bp片段；融合片段與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α態(tài)細(xì)胞，次日隨機(jī)挑取單克隆菌進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增出約2 000 bp片段的菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確者提質(zhì)粒并保菌。將陽性突變盒質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入16M感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌作為模板進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)以野生株16M作為對(duì)照(圖4)。結(jié)果顯示，抗性基因與外側(cè)引物組合鑒定，突變株能擴(kuò)增出預(yù)期大小目的片段，而16M無擴(kuò)增，表明構(gòu)建成功，命名為 16M-ΔBSR1526。

1, 3: Identification of N-homologous arm; 2, 4: Identification of C-homologous arm; 1, 2: 16M-ΔBSR1526; 3, 4: 16M; 3, 4: 16M control; M: DL2000 marker.圖4 BSR1526缺失突變株鑒定圖Fig.4 Verification of BSR1526 mutant

2.4.2 過表達(dá)株構(gòu)建 SI1526-F和SI1526-R為引物，擴(kuò)增出過表達(dá)片段，回收的目的片段進(jìn)行雙酶切，將pBBR1-MCS4質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。將雙酶切產(chǎn)物純化后，連接轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，涂Amp抗性LB平板并進(jìn)行菌落PCR，將鑒定正確的菌液送華大測(cè)序。Blast比對(duì)正確的即為陽性菌，提取陽性質(zhì)粒MCS4-BSR1526，電轉(zhuǎn)16M感受態(tài)細(xì)胞后涂抗性板，挑取單克隆菌以16M野生株為對(duì)照，同時(shí)16S為內(nèi)參進(jìn)行PCR(圖5)，結(jié)果表明，構(gòu)建的過表達(dá)株擴(kuò)增的條帶比野生株條帶亮，表明選取的單克隆菌模板DNA濃度高于野生株，過表達(dá)株構(gòu)建成功。

1: 16M; 2: 16M-BSR1526; M: DL2000 marker.圖5 BSR1526過表達(dá)株構(gòu)建鑒定圖Fig.5 Verification of BSR1526 overexpression strain

2.5 16M-△BSR1526 和16M-BSR1526的RT-PCR驗(yàn)證 圖6顯示，16M-△BSR1526未擴(kuò)增出BSR1955，16M-BSR1526擴(kuò)增出亮度大于野生株16M的條帶，表明16M-△BSR1526中缺失BSR1526轉(zhuǎn)錄，而16M-BSR1526中BSR1526轉(zhuǎn)錄水平增高，BSR1526過表達(dá)株構(gòu)建成功。

圖6 16M-△BSR1526 和16M-BSR1526的驗(yàn)證Fig.6 Verification of 16M-△BSR1526 and 16M-BSR1526 by RT-PCR

2.6 生長曲線 從圖7可以看出，對(duì)數(shù)生長期16M-△BSR1526和16M-BSR1526與野生株16M的生長曲線類似，到達(dá)穩(wěn)定期后突變株和過表達(dá)株的OD600值低于野生株。表明BSR1526的缺失或過表達(dá)影響了布魯氏菌的生長。

圖7 野生株、突變株和過表達(dá)株的生長曲線Fig.7 Growth curve of 16M, 16M-△BSR1526 and 16M-BSR1526

2.7 從圖8中可以看出，熱應(yīng)激和高滲透壓條件下16M-△BSR1526和16M-BSR1526的存活率與野生株相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在熱應(yīng)激、氧化壓力及酸性條件下，16M-△BSR1526的存活率明顯低于野生株16M。表明BSR1526缺失或過表達(dá)影響了布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境，BSR1526缺失或過表達(dá)后其抵抗熱應(yīng)激、氧化壓力及酸性環(huán)境的能力下降。

圖8 不同的刺激條件下16M、16M-△BSR1526和16M-BSR1526的存活率Fig.8 Intracellular survival of 16M, 16M-△BSR1526 and 16M-BSR1526 under stress conditions

2.8 小鼠毒力實(shí)驗(yàn) 從圖9中可以看出，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脾臟中的過表達(dá)株的載菌量與野生株的載菌量無差異；而在第14 d，突變株小鼠脾臟中的載菌量明顯低于野生株和過表達(dá)株，表明突變BSR1526后布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境的能力下降，被機(jī)體快速清除。提示BSR1526影響了布魯氏菌的毒力。

圖9 感染后小鼠脾臟載菌量Fig.9 Survival of 16M, 16M-△BSR1526 and 16M-BSR1526 in spleen of infected BALB/c mice

2.9 BSR1526靶基因的預(yù)測(cè) BSR1526調(diào)控了45個(gè)靶標(biāo)基因，其中25個(gè)位于布魯氏菌I號(hào)染色體，20個(gè)位于布魯氏菌II號(hào)染色體。這些靶基因編碼的蛋白包括20個(gè)胞質(zhì)蛋白、6個(gè)胞質(zhì)膜蛋白、1個(gè)外膜蛋白、1個(gè)周質(zhì)蛋白、17個(gè)蛋白定位尚不清楚。根據(jù)COG功能分類，這些靶基因主要包括碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、功能預(yù)測(cè)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及功能未知的蛋白等，它們可能參與布魯氏菌胞內(nèi)生存調(diào)控。

3 討 論

作為一種胞內(nèi)致病菌，適應(yīng)胞內(nèi)生存是布魯氏菌致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。胞內(nèi)存活和繁殖是布魯氏菌主要的毒力特征，其自身擁有一套抵抗和適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)殺菌或抑菌的能力，而這種適應(yīng)主要通過調(diào)控基因的協(xié)調(diào)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[17]。最近研究表明，致病菌進(jìn)入宿主后，感受環(huán)境改變并通過RNA調(diào)整自身毒力基因表達(dá)，有效地促進(jìn)細(xì)菌的生長、繁殖，從而利于胞內(nèi)菌在宿主胞內(nèi)的侵染和存活[18]。迄今已發(fā)現(xiàn)超過200個(gè)sRNA，大部分集中于模式細(xì)菌如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等。隨著研究的深入，越來越多的研究轉(zhuǎn)向致病菌，如霍亂弧菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。這些病原菌中已證實(shí)sRNAs在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，并在毒力調(diào)控中發(fā)揮作用[19-23]。目前關(guān)于布魯氏菌sRNA的研究還處于起步階段，了解sRNAs在布魯氏菌胞內(nèi)生存中的作用及其調(diào)控機(jī)制對(duì)理解布魯氏菌致病機(jī)制至關(guān)重要。

研究表明，布魯氏菌中存在sRNAs分子伴侶Hfq，且Hfq與布魯氏菌對(duì)高氧、酸等胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)和毒力有關(guān)[24]。Caswell CC等首次從B.abortus2308中鑒定出2個(gè)sRNAs(AbcR1 和 AbcR2)，同時(shí)突變2個(gè)sRNAs導(dǎo)致布魯氏菌的毒力下降，并且AbcR調(diào)控了大量靶基因，包括氨基酸代謝相關(guān)、多肽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等，發(fā)現(xiàn)AbcR能加速靶標(biāo)基因mRNA的降解[25]。國內(nèi)Hao Dong等采用SIPHT 、NAPP軟件對(duì)B.abortus2308在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的sRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，新發(fā)現(xiàn)112種sRNA。對(duì)其中20個(gè)新發(fā)現(xiàn)的sRNA采用RT-PCR驗(yàn)證了7種sRNA的存在[26]。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)一個(gè)調(diào)控鐵代謝基因hemH的sRNA(BsrH)，過表達(dá)BsrH影響了B.abortus2 308在應(yīng)激條件下的生存，但對(duì)胞內(nèi)以及小鼠體內(nèi)的繁殖無影響[27]。本實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)了B.melitensis16M中21個(gè)sRNA，其中8個(gè)sRNA得到驗(yàn)證。同時(shí)我們還對(duì)其中的一個(gè)新的sRNA進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，BSR0602參與調(diào)控了布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力[28]。Saadeh 等人通過Northern blot和RT-PCR對(duì)B.suis中發(fā)現(xiàn)的33個(gè)與Hfq相關(guān)的候選sRNA進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證出10個(gè)sRNA[29]。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序預(yù)測(cè)了羊種布魯菌16M中1 321個(gè)sRNA，對(duì)其中一個(gè)涉及布魯氏菌毒力相關(guān)的sRNA即BSR0441進(jìn)行研究。結(jié)果表明，BSR0441參與調(diào)控布魯氏菌在體內(nèi)的生存和繁殖。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BSR0441的缺失和過表達(dá)影響了其靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。以上研究都表明，布魯氏菌中存在大量sRNAs，并且這些sRNAs間接或直接參與調(diào)控布魯氏菌胞內(nèi)存活。

本研究中，經(jīng)Northern blot和RT-PCR驗(yàn)證了布魯氏菌中BSR1526的存在，BSR1526在酸性刺激條件下的轉(zhuǎn)錄水平高于其他刺激條件下的轉(zhuǎn)錄。本研究與郭英飛等人的研究結(jié)果相似，都表明sRNA在不同刺激條件下存在轉(zhuǎn)錄[30]。為進(jìn)一步研究BSR1526在布魯氏菌胞內(nèi)生存中的作用，我們采用融合PCR構(gòu)建BSR1526缺失株[31]，通過RT-PCR驗(yàn)證缺失株中不存在BSR1526轉(zhuǎn)錄。將BSR1526基因插入到多拷貝質(zhì)粒pBBR1-MCS4中，并將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入16M中，構(gòu)建過表達(dá)株16M-BSR1526。然后對(duì)16M-△BSR1526和16M-BSR1526的表型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，BSR1526影響了布魯氏菌的生長能力。之前報(bào)道sRNA在細(xì)菌適應(yīng)溫度、氧化應(yīng)激、pH等環(huán)境變化時(shí)起著重要的調(diào)控作用。如大腸桿菌的sRNA就是一種溫度感應(yīng)器，低溫時(shí)DsrA 大量表達(dá)，誘導(dǎo)基因進(jìn)行調(diào)控[32]。因此，我們對(duì)16M、16M-△BSR1526和16M-BSR1526在不同環(huán)境壓力條件下的存活率進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，BSR1526缺失或過表達(dá)影響了布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境的能力，缺失后抵抗熱應(yīng)激、氧化壓力及酸性環(huán)境的能力下降。小鼠毒力實(shí)驗(yàn)表明，缺失BSR1526后布魯氏菌在第14 d在小鼠脾臟內(nèi)的細(xì)菌量顯著下降，表明BSR1526影響了布魯氏菌的毒力。綜合以上研究，表明 BSR1526在布魯氏菌的胞內(nèi)生存以及毒力中起著重要作用。

細(xì)菌sRNA主要通過不完全堿基配對(duì)與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，進(jìn)而影響靶標(biāo)mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯或穩(wěn)定性發(fā)揮調(diào)控作用[4,28,33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BSR1526的靶標(biāo)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BSR1526調(diào)控了45個(gè)靶標(biāo)基因，這些靶基因在布魯氏菌2條染色體中都有分布。BSR1526可能通過調(diào)控這些靶基因的表達(dá)來調(diào)控布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力。45個(gè)靶基因中，BMEII0349，BMEII0703，BMEII0764與我們前期發(fā)現(xiàn)的BSR0441的靶基因一致，我們推測(cè)這3個(gè)靶基因可能同時(shí)受BSR0441和BSR1526調(diào)控[9]。后續(xù)我們將進(jìn)一步驗(yàn)證BSR1526與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系，分析BSR1526如何通過與靶標(biāo)基因相互作用進(jìn)而調(diào)控布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力，更好的理解BSR1526在布魯氏菌胞內(nèi)生存以及毒力中扮演的角色。

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Construction of mutant and overexpression strains with small noncoding RNA BSR1526 and study of its virulence inBrucella

XU Xiao-yang1, OU Hong-ping2, PENG Guang-neng1, LEI Shuang-shuang1,TIAN Yi-nan1, CAO Xue-feng1, WANG Yu-fei4,6,YAN Guang-wen6，ZHONG Zhi-jun1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2.ChengduVocationalCollegeofAgriculturalScienceandTechnology,Chengdu611130,China;3.DepartmentofLaboratoryMedicine,theGeneralHospitalofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Beijing100039,China；4.CollegeofVeterinaryMedicine,NajingAgricalturalUniversity,Najing210095,China)

To evaluate the roles of small noncoding RNA BSR1526 inBrucellaintracellular survival, the mutant and overexpression strains of BSR1526 were constructed and their survival capabilities under stresses that simulate intracellular environment and that of in mice were analyzed. Firstly, BSR1526 was verified by Northern blot and its transcription under stress conditions was verified by RT-PCR. The mutant strains of BSR1526 were constructed by fusion PCR. BSR1526 was inserted into the plasmid pBBR1-MCS4, which transformed intoBrucellamelitensis16M to generate the overexpression strain16M-BSR1526. At last, the survival capabilities of 16M-△BSR1526 and 16M-BSR1526 in different stimuli resembling thatBrucellaprobably encounters during infection and mice were analyzed. Our results showed that BSR1526 was transcribed inBrucella，and with different transcription levels under the stress conditions. Deletion or overexpression of BSR1526 affected the growth ofBrucellainvitro. The 16M-△BSR1526 showed reduced survival under heat shock, oxidative stress and acidic conditions, and significant reduction in mice, indicating that BSR1526 influenced the virulence ofBrucella. In summary, small noncoding RNA BSR1526 affects intracellular survival ability ofBrucellamelitensis16M. The ability adapting to hostile environments and virulence in mice with mutant BSR1526 strain was decreased.

Brucella; non-coding small RNA; BSR1526; intracellular survival

Zhong Zhi-jun, Email: zhongzhijun488@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.008

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31000548)；成都大熊貓繁育研究基金會(huì)項(xiàng)目(No.CPF2015-4)；北京市自然基金(No.6122030)；北京市科技新星資助項(xiàng)目(No.Z131102000413062)聯(lián)合資助。

鐘志軍，Email:zhongzhijun488@126.com； 王玉飛，Email:tosya@163.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 611130； 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130； 3.武警總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100039； 4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 216095

R378

A

1002-2694(2016)12-1083-08

2016-05-09；

2016-07-25

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31000548), the Chengdu Giant Panda Breeding Research Foundation (No. CPF2015-4), the Natural Science Foundation of Beijing (No. 6122030), and the Beijing Novo Program (No. Z131102000413062).