河南省26例甲型副傷寒沙門菌聚集性病例的病原學(xué)研究及溯源分析

趙嘉詠，張白帆，穆玉姣，蘇 佳，黃學(xué)勇，夏勝利，謝志強(qiáng)，許汴利

河南省26例甲型副傷寒沙門菌聚集性病例的病原學(xué)研究及溯源分析

趙嘉詠，張白帆，穆玉姣，蘇 佳，黃學(xué)勇，夏勝利，謝志強(qiáng)，許汴利

目的 分析2015年3-7月份河南省登封市分離自臨床診斷為副傷寒聚集性病例的甲型副傷寒(S.ParatyphiA)沙門菌病原學(xué)特征及分子流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。方法采集副傷寒病例患者的靜脈血8～10 mL，雙相血培養(yǎng)瓶37 ℃培養(yǎng)4～7 d，沙門菌科瑪嘉選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，系統(tǒng)生化鑒定，丹麥SSI分型血清進(jìn)行沙門菌O抗原及H1/2相鞭毛誘導(dǎo)血清凝集試驗(yàn)。根據(jù)PulseNet China病原體分子分型網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室公布的沙門菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)操作指南與美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)沙門菌K-B法藥敏測試方案對其進(jìn)行XbaI/BlnI雙酶切PFGE分子分型與聚類分析及8類13種抗生素藥敏測試。結(jié)果從29例病人血培養(yǎng)物中共分離到26株甲型副傷寒沙門菌，其經(jīng)XbaI與BlnI限制性雙酶切和PFGE電泳后帶型完全一致(PTYA1)；藥敏測試結(jié)果顯示24株甲型副傷寒沙門菌耐藥表型一致。結(jié)論病原學(xué)診斷及PFGE分子分型結(jié)果證實(shí)了26例甲型副傷寒沙門菌感染病例間可能存在高度的聚集性與分子流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步的追蹤溯源和調(diào)查取證提供了技術(shù)支撐。

甲型副傷寒沙門菌； 聚集性病例；藥敏測試；PFGE

甲型副傷寒是由甲型副傷寒沙門菌引起的急性消化道傳染病，臨床上以持續(xù)高熱、相對緩脈、特征性中毒癥狀、肝脾腫大、玫瑰疹與白細(xì)胞減少等為特征，腸出血、腸穿孔為主要并發(fā)癥。該病終年可發(fā)病，以夏秋季為多，一般呈散在發(fā)生，可出現(xiàn)局部暴發(fā)或流行，是我國法定報(bào)告的乙類傳染病之一[1-2]。登封市是河南省腸道傳染病及傷寒副傷寒重點(diǎn)監(jiān)測哨點(diǎn)地區(qū)之一，也是河南省歷年來甲型副傷寒散發(fā)和暴發(fā)病例的最主要來源地。2015年3月起，該地區(qū)臨床診斷副傷寒病例異常增多，病例無顯著時(shí)空聚集性，初步懷疑為散發(fā)性暴發(fā)事件，隨即河南省CDC傳染病實(shí)驗(yàn)室開展了病原學(xué)診斷與脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型與聚類分析，為臨床治療和及時(shí)啟動流行病學(xué)調(diào)查及防控措施的制定提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2015年3-7月間采集自河南省登封市2家醫(yī)院臨床診斷為副傷寒的病人靜脈血8～10 mL。26例病人中22例在市區(qū)內(nèi)，4例在城郊，呈市區(qū)聚集高發(fā)；職業(yè)分布廣泛，農(nóng)民14例、學(xué)生4例、干部職員和工人各6例、餐飲食品從業(yè)人員1例、幼托兒童1例。不同年齡組均有發(fā)病，以青壯年居多。對所有病例在外就餐或食用外購食品情況調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)共同暴露史。病例年齡主要集中于18～40歲，其中2～5歲1例，8～18歲4例，19～40歲21例；男性14例，女性12例，男女性別比1.2∶1。臨床癥狀以發(fā)熱、畏寒、頭痛為主。最高體溫波動在38.4 ℃～41.7 ℃，熱型以馳張熱最多，計(jì)有18例(69.2%)；其次為不規(guī)則熱，共計(jì)8例(30.8%)。7%～25%的病例有腹瀉、腹痛和便秘等消化道癥狀，均無玫瑰疹、表情淡漠、相對緩脈和肝脾腫大等典型癥狀，詳見表1。

表1 26例甲型副傷寒病例臨床表征統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Clinical characterization of 26 paratyphoid A cases

臨床表現(xiàn)Clinicalsymptoms例數(shù)Case比例%Percentage發(fā)熱fever26100．0畏寒Chills2492．3頭痛headache1973．1頭暈dizziness1246．2腹瀉diarrhea726．9腹痛bellyache415．4惡心sickness311．5便秘constipation27．7

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 雙相血培養(yǎng)瓶購自鄭州貝瑞特生物有限公司；沙門菌科瑪嘉鑒定培養(yǎng)基購自法國CHROMAgar公司；M-H瓊脂及藥敏紙片購自英國OXOID公司；API20E腸桿菌科細(xì)菌鑒定板條購自法國bioMérieux公司；沙門菌分型血清購自丹麥SSI公司；SeakemGold瓊脂糖購自瑞士LONZA公司；蛋白酶K購自英國Roche公司；限制性內(nèi)切酶XbaI購自大連寶生物公司；1 mol/L Tris-Hcl(pH8.0)、0.5 mol/L EDTA(pH8.0)、5×TBE購自Solarbio公司。

1.2.2 主要儀器 藥敏紙片分配器購自英國OXOID公司；VITEK2濁度儀購自法國bioMérieux公司；去離子水系統(tǒng)購自美國Milipore公司；脈沖場凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 甲型副傷寒沙門菌分離培養(yǎng)、生化鑒定與血清學(xué)分型 無菌抽取臨床診斷為副傷寒病人的靜脈血8～10 mL，雙相血培養(yǎng)瓶37 ℃培養(yǎng)4～7 d，挑取固相培養(yǎng)基上菌落或渾濁態(tài)培養(yǎng)液接種于沙門菌科瑪嘉選擇性培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后挑取邊緣整齊、光滑、凸起的淡紫色菌落轉(zhuǎn)種腦心浸液平板，0.85%生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染?，API20E腸桿菌科系統(tǒng)生化板條鑒定，SSI沙門菌診斷血清進(jìn)行O相玻片凝集分型，再利用0.4%營養(yǎng)軟瓊脂進(jìn)行H相(1/2相)鞭毛誘導(dǎo)與血清凝集，生理鹽水做自凝對照。根據(jù)卡芙曼-懷特(Kauffmann-White)血清分型表確定對應(yīng)血清型別[3]。

1.3.2 脈沖場凝膠電泳分型 按照Pulsenet China網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室公布的沙門菌脈沖場凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)分型方法[4]，對甲型副傷寒沙門菌株進(jìn)行分子分型，標(biāo)準(zhǔn)株H9812作為分子量標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶XbaI/BlnI(50U)，37 ℃酶切2.5 h。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，脈沖時(shí)間2.2～63.8 s，線性轉(zhuǎn)換，電場夾角120°，電泳時(shí)間19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗30 min后凝膠成像儀拍照(曝光時(shí)間3.0 s，去過飽和成像)。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 參照WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]，將甲型副傷寒沙門菌轉(zhuǎn)種腦心浸液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后0.85%生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙?。用無菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布于M-H平板表面，用分配器將藥敏紙片壓蓋其上，15 min內(nèi)送37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h以后測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2009年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥表型判定，大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 用BioNumerics6.0軟件對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制聚類分析樹狀圖。聚類算法為非加權(quán)配對平均法(UPGMA, Dice)，電泳條帶位置優(yōu)化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%認(rèn)定為同一PFGE帶型[6]。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌鑒定與血清學(xué)分型結(jié)果 26株沙門菌在沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基上均為紫紅色、邊緣整齊、光滑凸起小菌落； API20E腸桿菌科系統(tǒng)生化鑒定為沙門菌(ID%99.2%)，血清抗原式為1,2,12:a:-，參照卡芙曼-懷特(K-W)沙門菌血清分型手冊判定均為甲型副傷寒沙門菌。

2.2 藥敏測試結(jié)果 26株甲型副傷寒沙門菌中24株耐藥表型一致，其對氨芐西林(AMP)、增效磺胺類抗生素甲氧芐氨嘧啶(TMP)、四環(huán)素(TET)、鏈霉素(STR)、萘啶酸(NAL)、氯霉素(CHL)、頭孢噻肟(CTX)及復(fù)方新諾明(STX)耐藥； 對環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢吡肟(FEP)、諾氟沙星(NOR)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(GEN)敏感；其余2株菌耐藥譜與上述菌株有所不同，詳見表2。

表2 26株甲型副傷寒沙門菌多重耐藥譜

Tab.2 Multi-drug resistance spectrum of 26 strains S. paratyphi A

耐藥狀況Drugresistancekinds耐藥譜Drugresistancespectrum菌株數(shù)Strains耐6種SixkindsofresistanceAMP?CTX?TMP?NAL?CHL?SXT1耐8種EightkindsofresistanceAMP?TMP?TET?STR?NAL?CHL?CTX?SXT24耐9種NinekindsofresistanceAMP?TMP?CIP?TET?STR?NAL?CHL?NOR?SXT1

2.3 PFGE分子分型與聚類分析結(jié)果 26株甲型副傷寒沙門菌經(jīng)XbaI/BlnI雙酶切后帶型完全一致，命名為PTYA1，帶型相似度99.9%，具有顯著的帶型聚集性特征；從分子流行病學(xué)角度可高度懷疑由單一傳染源導(dǎo)致，詳見圖1。

圖1 26株甲型副傷寒沙門菌XbaI/BlnI雙酶切PFGE與聚類分析圖譜Fig.1 XbaI/BlnI PFGE cluster analysis of 26 strains of S. paratyphi A

3 討 論

登封市地處河南省中部，旅游業(yè)和商業(yè)發(fā)達(dá)，人員流動性較強(qiáng)。2007年，登封市曾經(jīng)暴發(fā)過一次較大規(guī)模的甲型副傷寒疫情，波及范圍廣，持續(xù)時(shí)間長，罹患人數(shù)多，給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)與社會發(fā)展造成了很大的影響，引起了相關(guān)政府部門的高度重視。近年來，當(dāng)?shù)卣付▽ｉT的醫(yī)療機(jī)構(gòu)收治傷寒副傷寒病人并在全市范圍內(nèi)持續(xù)開展大規(guī)模的愛國衛(wèi)生運(yùn)動和健康宣教活動，加強(qiáng)對病例的發(fā)現(xiàn)、治療和管理。由于甲型副傷寒慢性帶菌者的持續(xù)存在，疾病傳染源的多樣性及傳播途徑不易徹底切斷和人工免疫效果欠佳等原因，當(dāng)?shù)匦掳l(fā)散發(fā)性病例仍時(shí)有出現(xiàn)，3年來其實(shí)驗(yàn)室確診的病例數(shù)已占到河南省監(jiān)測病例數(shù)的97%以上。從2015年3月開始，當(dāng)?shù)夭±龜?shù)突然增多，至7月份已增至58例，具有初步的聚集性特征，盡管時(shí)空跨度相對較大，但足以引起我們的重視。通過對所有病例流行病學(xué)調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)共同接觸史、暴露史及飲水、食品等商品化暴露因素，這在河南省以往的沙門菌暴發(fā)病例中是比較罕見的。結(jié)合病原學(xué)診斷和流行病學(xué)資料綜合分析，我們高度懷疑這是一起由甲型副傷寒沙門菌感染引起的散發(fā)性暴發(fā)事件。 同時(shí)，確診病例以發(fā)熱、畏寒、頭痛為主，無出疹、肝脾腫大等典型癥狀，這也是近年來河南省以甲型副傷寒為代表的副傷寒病的主要臨床特征。從治療情況看，大部分病人普遍對三代氟喹諾酮類、四代頭孢及部分三代頭孢類等臨床一線用藥較為敏感，療效較為顯著，這和藥敏測試結(jié)果基本是一致的。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)能夠?qū)︻愃票景咐@種以高度散發(fā)形式存在的、在較長時(shí)間范圍內(nèi)跨地域傳播的病例進(jìn)行溯源調(diào)查分析，查找出各病例間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，這是以往靠傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查方法無法實(shí)現(xiàn)的，是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與現(xiàn)場流行病學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物。在美國“鼠傷寒沙門菌污染花生醬事件”、歐洲“O104出血性大腸桿菌”暴發(fā)疫情及國內(nèi)類似疫情的處置過程中，以PFGE技術(shù)為代表的網(wǎng)絡(luò)化監(jiān)測溯源平臺就發(fā)揮了不可替代的重要作用。在本研究中，我們就利用該技術(shù)將分布于不同地點(diǎn)不同發(fā)病時(shí)間的甲型副傷寒沙門菌散發(fā)性病例成功建立了流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。PFGE聚類分析技術(shù)雖然是比較成熟的技術(shù)體系，但是想要充分發(fā)揮它的作用，仍需要在試劑、方法、人員操作、分析算法等各個環(huán)節(jié)做好質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化工作，否則就容易在病例間建立錯誤的關(guān)聯(lián)，將流行病學(xué)調(diào)查指向錯誤的方向。PFGE技術(shù)目前在分辨度和識別力方面仍具有一定的技術(shù)局限性，提醒我們在實(shí)踐中要充分結(jié)合和深入分析病原學(xué)與流行病學(xué)信息，發(fā)揮各自優(yōu)勢的同時(shí)緊密合作，才能更好的把握疾病傳播特點(diǎn)，發(fā)揮PFGE技術(shù)在疾病防控、突發(fā)公衛(wèi)事件/疫情處置中的作用。

本研究中，24株甲型副傷寒沙門菌藥敏測試顯示其對青霉素類、部分三代頭孢類、一代喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類等8種抗生素呈耐藥性，且其多重耐藥譜又與PFGE帶型聚集性高度一致。這既反映了河南省病人分離株耐藥問題的嚴(yán)重性，也說明了基于共同暴露源的菌株往往具有相同的耐藥基因和表型特征，這種特征盡管存在變異性和不確定性，但在一定范圍內(nèi)可為及早發(fā)現(xiàn)聚集性病例提供重要線索。由于客觀原因我們在調(diào)查過程中始終未能從食物、水體等環(huán)境樣本中檢測出甲型副傷寒沙門菌，本文聚集性病例的調(diào)查沒有形成完整的病原學(xué)證據(jù)鏈，只能推論為由單一傳染源引起的散發(fā)性暴發(fā)，還需要做進(jìn)一步深入研究和分析。

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Pathogenic investigation and molecular tracing analysis in 26 clustered cases ofSalmonellaparatyphiA in Henan Province, China

ZHAO Jia-yong, ZHANG Bai-fan, MU Yu-jiao, SU Jia, HUANG Xue-yong,XIA Sheng-li, XIE Zhi-qiang, XU Bian-li

(CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016,China)

To investigate the etiological characteristics and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns ofSalmonellaparatyphiA strains isolated from patients of clustered cases in 2015 in Dengfeng City, Henan Province, 8-10 mL venous blood samples were collected from patients of paratyphoid and cultured in double phase blood culture bottle for 4-7days, then suspicious strains were identified and been madeSalmonellaO antigen and H1/2 phase flagellum-induced serum agglutination test by API20E biochemical systems and SSISalmonellatyping sera. According toSalmonellamolecular typing and K-B drug susceptibility testing method published by PulseNet China bacterial infectious disease monitoring network and USA clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecule characteristics ofS.paratyphiA strains isolates from patients. Results showed that 26 strains ofS.paratyphiA were isolated from 29 cases of blood samples, the antigen modes of them were 1,2,12:a:-. They were divided into only one molecular patterns (PTYA1) by digestion withXbaI/BlnI and pulsed field gel electrophoresis. The pattern similarity were 100%. Drug susceptibility test results also showed most strains had the same resistant phenotypes with the consistent resistance spectrum for AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-CTX-SXT. The PFGE technology confirmed the molecular epidemiological relevance among 26S.paratyphiA infection cases, providing the technical support for further epidemiological tracing and investigation.

SalmonellaparatyphiA; clustered cases; AST; PFGE Supported by the National Science and Technology Major Project(Nos. 2012ZX10004201 & 2012ZX10004203) Corresponding author: Xu Bian-li, Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.015

國家科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX10004201和No.2013ZX10004203)聯(lián)合資助

許汴利，Email：xubl@hncdc.com.cn

河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州 450016

R373

B

1002-2694(2016)12-1122-04

2016-04-06；

2016-07-13