吳茱萸堿誘導人胃癌SGC7901細胞凋亡及機制研究

張 弦金曉瀅

吳茱萸堿誘導人胃癌SGC7901細胞凋亡及機制研究

張 弦1金曉瀅2

目的觀察吳茱萸堿對胃癌SGC7901細胞的抑制作用，探討其可能的分子機制。方法體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細胞，用不同濃度的吳茱萸堿作用于SGC7901細胞24h。MTT比色法觀察吳茱萸堿對SGC7901細胞增殖活性的影響；倒置相差顯微鏡及熒光電鏡觀察細胞凋亡狀態(tài)；流式細胞儀檢測SGC7901細胞凋亡情況；用RT-PCR檢測不同濃度的吳茱萸堿干預24h后SGC7901細胞Survivin和Caspase-3mRNA表達。結果吳茱萸堿能抑制SGC7901細胞增殖，呈劑量依賴性；倒置相差顯微鏡及熒光電鏡下均觀察到典型的細胞凋亡狀態(tài)；吳茱萸堿可誘導SGC7901細胞凋亡,且隨劑量增加作用增強；隨吳茱萸堿濃度的增加，細胞內(nèi)Survivin基因表達強度逐漸降低，Caspase-3表達強度逐漸增強。結論吳茱萸堿能抑制人胃癌SGC7901細胞增殖并誘導其凋亡，SGC7901細胞中Survivin mRNA表達水平顯著降低，從而可能下調(diào)其對Caspase-3的抑制作用，使細胞凋亡增加。

人胃癌SGC7901細胞；吳茱萸堿；凋亡；Survivin；Caspase-3

吳茱萸堿為蕓香科植物吳茱萸近成熟干燥果實，其主要化學成分為揮發(fā)油類及生物堿類，其中吳茱萸堿為主要活性物質(zhì)。近年來，吳茱萸堿的抗腫瘤活性被陸續(xù)報道，但作用機制仍有待深入研究。凋亡是在基因調(diào)控下的細胞程序化死亡。正常細胞的增殖、分化和凋亡存在一種平衡，故誘導凋亡是腫瘤治療的一條重要途徑。本文采用不同濃度的吳茱萸堿體外干預SGC7901胃癌細胞，觀察其對胃癌的抑制增殖及誘導凋亡作用，并對其機制作初步研究。

1 材料與方法

1.1 藥品及細胞 吳茱萸堿標準品購自Sigma公司；人胃癌細胞株SGC7901購自中國科學院細胞庫。

1.2 試 劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，噻唑藍購自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Becman Coulter公司。

1.3 方 法 將SGC7901細胞株接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁培養(yǎng)，每2～4天傳代1次。細胞傳代時用0.25%胰酶，在37℃條件下消化2～3min，適量培養(yǎng)基吹打成細胞懸液后接種。

1.3.1 MTT法檢測不同濃度吳茱萸堿對SGC7901細胞的抑制作用[1]取生長狀態(tài)好，處于對數(shù)生長期的細胞系，常規(guī)胰酶消化后培養(yǎng)液吹打成細胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)后將細胞密度調(diào)整為（4～5）×104/mL的細胞懸液?？装迕靠准尤爰毎麘乙?00μL，培養(yǎng)液100μL，調(diào)零孔加入200μL培養(yǎng)液。細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度的吳茱萸堿，使其終濃度分別為3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L，對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。每個劑量5個平行孔。于24h后取96孔培養(yǎng)板，每孔加入新鮮配制的濃度為5g/L的MTT 20μL。繼續(xù)培養(yǎng)3h后取出培養(yǎng)板，小心吸棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150μL，輕輕震蕩10min后，用酶聯(lián)儀于490nm處測出各孔吸光度值，按下式計算細胞抑制率：細胞抑制率=（1-給藥孔平均OD值/對照孔平均OD值）×100%。實驗重復3次。

1.3.2 細胞凋亡形態(tài)學觀察

1.3.2.1 倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)學變化[2]取對數(shù)生長期人胃癌細胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度為1.2×104/mL，以每孔2mL細胞懸液接種于6孔板（各孔內(nèi)預先放置無菌蓋玻片1張），十字晃動使細胞分布均勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期后，棄去舊培養(yǎng)液，各孔加入含 0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿培養(yǎng)液2mL，置于37℃、5%CO2的培箱中，于24h后倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)學變化。

1.3.2.2 熒光電鏡下觀察形態(tài)學變化（Hochest染色）

將1.2×104個細胞接種于6孔板，每孔2mL，過夜，待細胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，加入含0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)基留作備用，0.25%胰酶EDTA消化，加入收集培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，1000rpm離心5min，留少許上清重懸沉淀，4%多聚甲醛室溫固定5min，PBS離心洗滌2次，每次3min，留少許上清約100μL，加入10μL Hochest染液室溫避光染30min，再用PBS洗兩遍，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋玻片封片，盡量避免氣泡產(chǎn)生。熒光顯微鏡下觀察，拍照。每個樣品隨機計數(shù)500個細胞，計算凋亡細胞百分率。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別消化收集以0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L藥物處理24h的胃癌細胞。收集細胞后，調(diào)整濃度至1×106/mL，3000rpm離心5min，吸棄上清，保留細胞，PBS重懸細胞離心2次，加入預冷的結合緩沖液100μL重懸細胞，置冰浴，加入5μL Annexin V/FITC和10μL PI于細胞懸液中，輕輕混勻，將試管至于室溫避光染色15min，補加400μL結合緩沖液混懸細胞，流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡百分比。

1.3.4 RT-PCR檢測凋亡調(diào)節(jié)基因mRNA表達

1.3.4.1 總RNA抽提 收集細胞于1.5mL Ennerdorf管（無RNA酶、無菌），加入1mL Trizol，充分混勻后，室溫靜置15min。加200μL氯仿，充分混勻，4℃，15000rpm，離心8min。取上清（約500μL），至1.5mL Eppendorf管（同上），加500μL異丙醇，混勻，4℃，15000rpm，20min。棄上清，用75%乙醇1mL沖洗沉淀，高速離心5min。棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥（2～3min）。將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中。將總RNA作適當稀釋（DEPC水）后，分光光度計測OD260/OD280的比值，并定量。定量公式：RNA濃度（μg/mL）=OD260值×40×稀釋倍數(shù)（本實驗為400倍）。結果顯示OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，表示RNA無降解。

1.3.4.2 逆轉錄PCR反應 按下列順序在1.5mL離心管中加入下列反應物（體積為12.5μL，總RNA體積與DEPC水的總體積是8μL，其中RNA的量是2μg）：DEPC水，RNA酶抑制劑（50U/μL）0.5μL，隨機引物（50pM/μL）2μL，RNA。在65℃水浴處理5min。室溫放置10min，高速（高于5000g）離心5s。按下列順序加在1.5mL離心管入下列反應物（加入之后總體積為20μL）：RNA酶抑制劑（50U/μL）0.5μL，5× buffer（Promega）4μL，dNTP MIX（10mM/each）2μL，DTT 2μL，M-MLV（200U/μL）1μL，水浴37℃下反應1h，90℃處理5～10min，冰浴5min，高速離心5s，所得cDNA作PCR。引物序列由上海捷蘭生物技術有限公司設計并合成，序列見表1。PCR反應所加成分（20μL體系）：H2O 12.1μL，10pM Primer1 0.2μL，10pM Primer2 0.2μL，20x sybr 0.5μL，2.5mM dNTP 0.4μL，25mM Mg2+2.4μL，10xbuffer 2μL，5u/μL Taq 酶0.2μL，模板2μL。反應條件為：（1）94℃ 2min；（2）94℃ 40s，50～65℃ 40s，72℃ 1min，35個循環(huán)；（3）72℃ 5min。經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上照相并進行密度掃描分析，重復5次。以各PCR產(chǎn)物密度/GADPH來表示各檢測指標mRNA的相對含量，進行半定量分析[3-4]。

表1 引物序列及長度

2 結 果

表2 吳茱萸堿對SGC7901細胞生長的抑制率（±s）

表2 吳茱萸堿對SGC7901細胞生長的抑制率（±s）

注：與對照組比較,△P＜0.05

2.1 不同濃度的吳茱萸堿對SGC7901細胞的生長抑制作用 在3～48umol/L濃度范圍內(nèi)，吳茱萸堿作用24h后，對SGC7901細胞的增殖有顯著的抑制作用（P＜0.05），并且隨著吳茱萸堿濃度的增加，對細胞的抑制率也逐漸增加（見表2），可見吳茱萸堿以劑量依賴方式抑制SGC7901細胞生長。

2.2 細胞凋亡形態(tài)學觀察 相差倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：正常情況下細胞生長良好，形狀不規(guī)則，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生長有巢狀現(xiàn)象，細胞核大，核異型，核質(zhì)比高，可見異常核分裂相。不同濃度的作用于癌細胞后可見懸浮細胞增多，細胞漿混濁，細胞胞體縮小、變圓、皺縮、核固縮、碎裂，細胞折光性減弱，細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，培養(yǎng)液中有較多的細胞碎片（見插頁圖1）。

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：不同濃度吳茱萸堿作用24h后，0mmol/L吳茱萸堿作用組染色質(zhì)分布均勻，呈彌散均勻藍白色熒光；而隨著濃度增加，可見細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核碎裂，染色質(zhì)分割成塊，細胞核成致密濃染的顆粒狀熒光和形成凋亡小體等典型的凋亡細胞形態(tài)改變。3、6μmol/L吳茱萸堿作用組部分細胞染色質(zhì)呈濃染的塊狀或顆粒狀，聚集于核周邊或裂解成碎片，并出現(xiàn)凋亡小體；12、24、48μmol/L吳茱萸作用組較多細胞胞內(nèi)染色質(zhì)分布不均，形成熒光斑點，呈凋亡特征性（見插頁圖2）。

2.3 流式細胞儀檢測及細胞凋亡率比較 Annexin V-PI雙染色法檢測顯示隨著吳茱萸堿濃度的增加，SGC7901細胞的早期凋亡率逐漸增加（見表3，插頁圖3）。

表3 吳茱萸堿誘導SGC7901細胞凋亡的作用（±s）

表3 吳茱萸堿誘導SGC7901細胞凋亡的作用（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05

組別對照組吳茱萸堿3μmol/L組吳茱萸堿6μmol/L組吳茱萸堿12μmol/L組吳茱萸堿24μmol/L組吳茱萸堿48μmol/L組早期凋亡0.67±0.16 8.54±1.28△13.69±2.71△20.42±3.45△31.66±5.13△44.35±7.34△晚期凋亡和壞死1.49±0.23 4.36±0.64△10.43±2.01△16.79±3.06△23.83±4.11△32.54±5.48△

2.4 吳茱萸堿對胃癌SGC7901細胞Survivin、Caspase-3基因表達的影響 RT-PCR產(chǎn)物電泳后，SGC7901細胞對照組可見明亮的Survivin擴增條帶，半定量分析Survivin基因表達強度發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，吳茱萸堿各組隨吳茱萸堿濃度的增加，Survivin基因表達強度逐漸降低（見插頁圖4）。

與SGC7901細胞對照組caspase-3mRNA表達水平比較，3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L吳茱萸堿作用24h后，caspase-3 mRNA表達強度逐漸增加（見圖5插頁）。

3 討論

本研究觀察了從傳統(tǒng)中藥吳茱萸中得到的天然活性成分吳茱萸堿對SGC7901增殖的影響，實驗證明，吳茱萸堿對SGC7901細胞增殖有抑制作用，其抑制作用隨著吳茱萸堿濃度的增加而增強，通過倒置相差顯微鏡及熒光電鏡下觀察，隨著吳茱萸堿濃度增加，可見SGC7901細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核碎裂，染色質(zhì)分割成塊，細胞核成致密濃染的顆粒狀熒光和形成凋亡小體等典型的凋亡細胞形態(tài)改變。

Annexin V-PI雙染色法檢測顯示0～48μmol/L處理胃癌細胞后，凋亡及壞死細胞數(shù)明顯增多，并且有濃度依賴性，而凋亡率變化比壞死更顯著，說明在該濃度范圍內(nèi)誘導胃癌細胞凋亡效應要強于引起細胞壞死的作用，證實吳茱萸堿誘導細胞凋亡是殺傷胃癌細胞的作用機制之一。近年發(fā)現(xiàn)IAPs在抑制細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Survivin作為IAP基因家族成員之一，主要表達于細胞有絲分裂周期中S期及G2/M期[5]，廣泛表達于各種腫瘤組織中，而在正常組織中不表達或低表達，顯示其在癌組織中處于失控的表達狀態(tài)[6]，胃癌組織Survivin表達與胃癌凋亡指數(shù)呈負相關。本研究結果表明，在胃癌細胞SGC7901中Survivin基因表達明顯，隨著吳茱萸堿濃度的增加，Survivin mRNA表達逐漸降低，提示吳茱萸堿可能下調(diào)Survivin mRNA的表達。caspases是特異水解天冬氨酸羧基側肽鏈的半胱胺酸銨蛋白酶，它們在細胞中是一系列靜止的酶原，一旦被激活，效應caspases就引起一系列的水解反應，最終導致細胞死亡。目前普遍認為caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡兩途徑線粒體通路和死亡受體通路共同的效應劑，它單獨或協(xié)同參與水解許多與凋亡有關的蛋白質(zhì)，它的活化必然引起caspase-3級聯(lián)反應，引起細胞凋亡[7-8]。本研究結果顯示，SGC7901中caspase-3mRNA的表達水平隨著吳茱萸堿濃度的增加而逐漸增加。經(jīng)過吳茱萸堿的誘導作用，SGC7901細胞中Survivin mRNA表達水平顯著降低，從而可能下調(diào)其對終末效應蛋白caspase-3的直接或間接抑制作用，使細胞凋亡增加。

吳茱萸堿誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡，是其對該細胞體外抑制增殖作用的重要分子機制。除促進Survivin表達，下調(diào)caspase-3凋亡通路外，還可能還涉及其他的機制，有待進一步研究。本研究中不同濃度吳茱萸堿均作用于SGC7901細胞24h，后續(xù)可繼續(xù)研究不同作用時間與吳茱萸堿抑制作用之間的關系。

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（收稿：2015-08-20 修回：2015-10-10）

Effect of Evodiamine on Apoptosis of Gastric Cancer Cell SGC7901 and the Primary Mechanism

ZHANGXian1,允IN Xiaoying2. 1 Department of Traditional Chinese Medicine,Women's Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China;2 Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Afflicted Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of evodiamine on apoptosis of human gastric cancer cell SGC7901 and to identify the underlying molecular mechanism.MethodsGastric cancer cell SGC7901 were cultured in vitro and treated by evodiamine of 0-48μmol/L concentrations for 24h.Inhibition on the proliferation of SGC7901 cells was assessed by MTT assay.The morphology of SGC7901 cells treated was observed by optical microscope.Gene transcription of survivin and caspase-3 in SGC7901 cells was also examined by RT-PCR.ResultsThe proliferation of SGC7901 cells was inhibited by evodiamine in a dose-dependent manner.Characteristic apoptosis was confirmed by optical microscope,and Hoechst 33258 staining analysis indicated that evodiamine caused typical characteristics of apoptotic programmed cell death.Flow cytometric analysis demonstrated that evodiamine caused a dose-dependent apoptosis of SGC7901 cells.The transcription of survivin gene showed decreasing tendency,and the caspase-3 gene showed increasing tendency when treated by 0-48μmol/L evodiamine for 24 h.ConclusionEvodiamine can inhibit the proliferation of SGC7901 cells and promot its apoptosis.Evodiamine down-regulated survivin mRNA levels and up-regulated the expression of caspase-3,and activated the activities of caspase-3 in the cells and eventually induced apoptosis in SGC7901 cells.

human gastric cancer cell SGC7901;evodiamine;apoptosis;survivin;caspase-3

1浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310000）；2浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310000）

張弦，Tel：13958015698