耐鹽溶磷菌PSB7的鑒定及其溶磷效果研究

范延輝，王 君*，李學(xué)平

(1.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603； 2.濱州學(xué)院 資源環(huán)境系，山東 濱州 256603)

耐鹽溶磷菌PSB7的鑒定及其溶磷效果研究

范延輝1，王 君1*，李學(xué)平2

(1.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系/山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603； 2.濱州學(xué)院 資源環(huán)境系，山東 濱州 256603)

通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析對(duì)一株分離自黃河三角洲地區(qū)沾化冬棗根際土壤的菌株P(guān)SB7進(jìn)行鑒定，并對(duì)其耐鹽特性和溶磷效果進(jìn)行測(cè)定，為其在提高鹽堿化土壤磷素利用率方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，菌株P(guān)SB7為土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)，在5～35 g/L 的NaCl液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。PSB7具有較強(qiáng)的溶磷能力，在改良蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，有效磷含量達(dá)72.26 mg/L，是無(wú)菌株對(duì)照的14.54倍。在含鹽量0.45%的鹽堿化土壤中添加PSB7，培養(yǎng)40 d，土壤中的有效磷含量由68.75 mg/L增加至96.60 mg/L，比未接菌對(duì)照增加了40.5%。菌株P(guān)SB7兼具耐鹽和溶磷特性，在改善鹽堿化土壤肥力方面具有很好的應(yīng)用前景。

耐鹽； 溶磷菌； 鑒定； 根際

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一[1]。然而，由于土壤的固定作用，土壤中的有效磷含量極低，絕大部分有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷以難溶性磷酸鹽形式存在，植物不能直接吸收利用，使磷成為制約作物生產(chǎn)的主要因素[2]。因此，開(kāi)發(fā)土壤磷資源潛能，提高土壤磷素利用率，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[3]。黃河三角洲是我國(guó)最大的三角洲，地域遼闊，自然資源豐富，然而，近年來(lái)黃河斷流影響了黃河三角洲地區(qū)淡水水源的補(bǔ)給，破壞了土壤中水鹽的平衡，致使土壤鹽堿化現(xiàn)象嚴(yán)重[4]，鹽堿地面積已達(dá)44.3萬(wàn)hm2，占全區(qū)耕地總面積的52.5%。鹽堿化土壤特殊的理化性質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致傳統(tǒng)的非土著溶磷菌定殖能力差、競(jìng)爭(zhēng)力較弱、溶磷能力退化快、菌種淘汰率高等[2]。因此，篩選土著耐鹽溶磷菌對(duì)于開(kāi)發(fā)微生物肥料、提高鹽堿土壤磷素利用率具有重要意義。大量研究結(jié)果證明，土壤中存在著大量的溶磷微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為易于被吸收利用的有效磷，從而提高土壤的供磷水平[5-6]；同時(shí)，溶磷微生物還能分泌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)農(nóng)作物根系對(duì)鋅、銅等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，增強(qiáng)植物抗病能力[7]。然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于溶磷微生物的研究主要側(cè)重菌株的溶磷水平[2-3,6-16]，關(guān)于菌株的耐鹽性如何卻鮮有報(bào)道。為此，本研究對(duì)從黃河三角洲地區(qū)沾化冬棗根際土壤中篩選獲得的一株溶磷細(xì)菌PSB7，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其耐鹽性和溶磷能力，為提高鹽堿化土壤磷素利用率提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株P(guān)SB7是從黃河三角洲地區(qū)沾化冬棗根際土壤中分離到的一株細(xì)菌。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0。

改良蒙金娜無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)210 g、酵母膏0.4 g、水1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株P(guān)SB7的形態(tài)觀察 在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上劃線接種菌株P(guān)SB7，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察菌株的生長(zhǎng)情況及菌落特征；挑取單菌落置于潔凈玻片上，革蘭氏染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及染色情況。

1.2.2 菌株P(guān)SB7的生理生化特性測(cè)定 參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]進(jìn)行。

1.2.3 菌株P(guān)SB7的16S rDNA序列測(cè)定及分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 采用細(xì)菌總DNA 提取試劑提取菌株基因組DNA。用細(xì)菌l6S rDNA通用引物(27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L上游引物27f 1 μL、10 μmol/L下游引物1492r 1 μL、3 UTaqplus DNA聚合酶、10× PCR buffer 2.5 μL、模板DNA 0.5 μg。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用Bio-Rad凝膠成像儀成像觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。PCR產(chǎn)物測(cè)序后用BLAST進(jìn)行相似性搜索和同源性比對(duì)，采用ClustalX 2.0進(jìn)行序列比對(duì)分析，通過(guò)MEGA 4.1軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 菌株P(guān)SB7的耐鹽性測(cè)定 調(diào)整牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中NaCl的加入量，使NaCl質(zhì)量濃度分別為5、15、25、35、45 g/L，接種量為1%，pH值7.0，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，于600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度[18]。

1.2.5 菌株P(guān)SB7的溶磷能力測(cè)定 將菌株P(guān)SB7以1%的接種量置于改良蒙金娜液體培養(yǎng)基中，無(wú)菌株處理為對(duì)照，30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔24 h取5 mL 培養(yǎng)液進(jìn)行測(cè)定，其中2 mL低速(1 500 r/min)離心3 min，用等體積1 mol/L HCl稀釋?zhuān)コ锨逡褐袣埩舻牧姿徕}顆粒，于600 nm測(cè)定吸光度[19]；剩余的3 mL培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min，取上清液，用鉬藍(lán)比色法測(cè)定有效磷含量，并測(cè)定pH值[19]。

1.2.6 菌株P(guān)SB7在鹽堿化土壤中的溶磷能力測(cè)定 供試土壤采自沾化縣冬棗園表層(5～20 cm)土，含鹽量約0.45%，為輕度鹽堿化土壤。將菌株P(guān)SB7以1%的接種量置于改良蒙金娜液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。取5 mL菌懸液，均勻噴灑入裝有50 g土壤、容量為500 mL的錐形瓶中，以無(wú)菌水為對(duì)照。向土壤中添加適量尿素(0.36 g/kg)[20]，以補(bǔ)充氮源，每隔3 d噴灑無(wú)菌水，使土壤含水量保持在15%～20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。28 ℃恒溫培養(yǎng)60 d，每周翻動(dòng)土壤2次。利用Olsen法提取土壤中的有效磷，采用鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷含量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)SB7的形態(tài)學(xué)特征

菌株P(guān)SB7為革蘭氏陰性菌，桿狀，無(wú)芽孢，大小為(1.5～0.3)μm ×(0.6～1.0)μm，能運(yùn)動(dòng)。在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色、不透明、圓形，表面較黏稠、凸起，易挑取(圖1)。

圖1 菌株P(guān)SB7的菌落形態(tài)

2.2 菌株P(guān)SB7的生理生化特性

菌株P(guān)SB7能夠還原硝酸鹽、水解淀粉、水解纖維素、液化明膠，不能凝固但能胨化牛奶，能夠利用D-半乳糖、甘油、L-鼠李糖、麥芽糖、葡萄糖、D-木糖、乳糖、山梨糖，不能利用蔗糖、肌糖、L-阿拉伯糖。根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]可初步判斷該菌為土壤桿菌屬(Agrobacterium)。

2.3 菌株P(guān)SB7的16S rDNA序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后菌株P(guān)SB7的16S rDNA序列全長(zhǎng)為1 413 bp，將該序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)為KJ957935)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。BLAST分析結(jié)果顯示,該序列與土壤桿菌屬(Agrobacterium)的16S rDNA序列具有很高的同源性，其中與根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens(DQ790018.1、AY850392.1、AY513490.1)、放射形土壤桿菌Agrobacteriumradiobacter(AJ130719.1)及土壤桿菌Agrobacteriumsp.DB14(JQ437544.1)的16S rDNA序列相似性均為98%。綜合形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征，確定菌株P(guān)SB7為土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。

圖2 基于菌株P(guān)SB7 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 菌株P(guān)SB7的生長(zhǎng)狀況及溶磷能力分析

菌株P(guān)SB7在改良蒙金娜液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，PSB7發(fā)酵液中有效磷含量在24～96 h表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，隨后有效磷含量趨于平穩(wěn)，7 d后有效磷含量高達(dá)72.26 mg/L，而對(duì)照組的有效磷含量?jī)H為4.97 mg/L(圖3)。菌體密度呈現(xiàn)出先迅速增高然后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖4)。發(fā)酵液的pH值總體呈下降趨勢(shì)(圖4)，pH值(y)與有效磷含量(x)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)性方程為y=-0.063 8x+7.695 6，R2=0.758)，但相關(guān)性不顯著。

圖3 菌株P(guān)SB7發(fā)酵液中有效磷含量

圖4 菌株P(guān)SB7在無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及pH值變化情況

2.5 菌株P(guān)SB7的耐鹽性分析

菌株P(guān)SB7的耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，菌株P(guān)SB7的生長(zhǎng)量先增加后降低，在NaCl質(zhì)量濃度為5～35 g/L 的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在NaCl質(zhì)量濃度為45 g/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中也能緩慢生長(zhǎng)。綜上，菌株P(guān)SB7具有較強(qiáng)的耐鹽性。

圖5 菌株P(guān)SB7在不同NaCl質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)情況

2.6 菌株P(guān)SB7在鹽堿化土壤中的溶磷能力分析

為了確定菌株P(guān)SB7在鹽堿化環(huán)境中的應(yīng)用潛力，對(duì)PSB7進(jìn)行了鹽堿化土壤溶磷效果研究。接種菌株P(guān)SB7后供試土壤有效磷含量如圖6所示。由圖6可以看出，在60 d的測(cè)定期內(nèi)，接菌土壤中的有效磷含量均較未接菌對(duì)照明顯提高，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其呈先增加后降低的趨勢(shì)， 40 d時(shí)有效磷含量最高，達(dá)96.60 mg/L，比未接菌對(duì)照增加了40.5%。

圖6 菌株P(guān)SB7在鹽堿化土壤中的溶磷情況

3 結(jié)論與討論

自1903年Stalstrom[22]從土壤中發(fā)現(xiàn)溶磷微生物以來(lái)，世界各國(guó)相繼展開(kāi)了相關(guān)研究。迄今為止，已報(bào)道的溶磷微生物有36個(gè)屬89種，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等類(lèi)群[3,23]。其中，關(guān)于溶磷細(xì)菌的報(bào)道最多，主要有土壤桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸細(xì)菌屬(Enterobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、固氮菌屬(Azotobacter)和多硫桿菌屬(Thiobacillus)等[24]。目前，關(guān)于溶磷微生物的研究主要集中在溶磷能力方面[25-26]，許多溶磷細(xì)菌具有很強(qiáng)的溶磷能力。白文娟等[27]對(duì)玉米根際溶磷細(xì)菌進(jìn)行分離，篩選出38 株溶解無(wú)機(jī)磷菌株，其中代表性溶磷細(xì)菌SWJ1-4的溶磷量為108.31 mg/L；戴沈艷等[28]從江西鷹潭紅壤中分離獲得一株性狀穩(wěn)定的高效溶磷細(xì)菌T4，該菌溶解AlPO4、磷礦粉的能力均比較高，分別為334.2 、193.1 mg/L。但這些溶磷菌并不一定能適應(yīng)鹽漬化環(huán)境，并在鹽堿化土壤中定植進(jìn)而發(fā)揮其溶磷作用。研究表明，溶磷菌的分布呈強(qiáng)烈的根際效應(yīng)，即根際土壤中溶磷微生物的數(shù)量較非根際土壤中多[2]。近年來(lái)，從植物根際土壤中篩選高效溶磷菌成為提高土壤磷有效性研究的熱點(diǎn)[29-30]。本研究篩選到的土壤桿菌PSB7的溶磷能力為72.26 mg/L，雖然與其他已報(bào)道農(nóng)作物根際溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的溶磷能力相比不是很高，但PSB7較強(qiáng)的耐鹽性為其在鹽堿化土壤中的應(yīng)用提供了保障。菌株P(guān)SB7在鹽堿化土壤中的溶磷效果表明，該菌在提高鹽堿化土壤磷素利用率方面有很大潛力。

微生物的溶磷機(jī)制因菌株的不同而有所不同，主要有有機(jī)酸的分泌、質(zhì)子的釋放、H2S作用、CO2作用和產(chǎn)生磷酸酶[2]。研究表明，產(chǎn)低分子量有機(jī)酸是微生物溶磷的主要機(jī)制[31-32]，在酸性條件下難溶性磷酸鹽能夠溶解；另外，有機(jī)酸可與磷礦粉中鐵、鋁、鎂、鈣等金屬離子發(fā)生沉淀、絡(luò)合、螯合反應(yīng)，從而使磷酸根釋放出來(lái)。因此，微生物的溶磷能力往往與培養(yǎng)液的pH值存在一定的負(fù)相關(guān)性[29-30]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)SB7在液體蒙金娜培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液的pH值在培養(yǎng)7 d內(nèi)一直呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，雖然溶磷量與培養(yǎng)基pH值呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，其具體溶磷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Identification of Phosphate-solubilizing Halotolerant Strain PSB7 and Its Phosphate-solubilizing Effect

FAN Yanhui1,WANG Jun1*,LI Xueping2

(1.Department of Life Sciences,Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta,Binzhou 256603,China; 2.Department of Resource and Environment,Binzhou University,Binzhou 256603,China)

A phosphate-solubilizing strain PSB7 isolated from the rhizosphere of winter jujube was identified based on its morphology,physio-biochemical characters and 16S rDNA sequence analysis,and its salt resistance ability and phosphate-solubilizing effect were also studied to provide a theoretical basis for improving saline soil phosphorus utilization rate.Strain PSB7 was identified asAgrobacteriumsp.The salt resistance test demonstrated that strain PSB7 grew well under NaCl concentration of 5—35 g/L.PSB7 could produce 72.26 mg/L available phosphate after 7 days in the liquid tricalcium phosphate medium,which was 14.54 times more than the control,and increase the available phosphate content by 40.5%,from 68.75 mg/L to 96.60 mg/L,after 40 days in the soil with 0.45% salinity.Strain PSB7 had both phosphate-solubilizing and salt-resistance properties,which had great potential to improve phosphorus utilization rate in saline soil.

halotolerancy； phosphate-solubilizing microorganism； identification； rhizosphere

2016-01-23

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J10LC55)；濱州學(xué)院科研基金項(xiàng)目(2009ZDL03，BZXYFB20110512)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GNC111018)

范延輝(1980-)，男，山東即墨人，講師，碩士，主要從事土壤微生物研究。E-mail：yanhuifan@163.com

*通訊作者：王 君(1982-)，女，山東濱州人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物研究。E-mail：ivywangjun@163.com

S154.39

A

1004-3268(2016)07-0056-05