反向間接血凝試驗（RIHA）在動物疾病診斷中的應用進展

莊金秋，梅建國，王　艷，謝金文，莫　玲，沈志強（. 山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州　256600；2. 濱州市貝爾凱瑞生物技術有限公司，山東濱州　256600）

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反向間接血凝試驗（RIHA）在動物疾病診斷中的應用進展

莊金秋1，2，梅建國1，2，王艷1，謝金文1，莫玲1，沈志強1
（1. 山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2. 濱州市貝爾凱瑞生物技術有限公司，山東濱州256600）

摘要：反向間接血凝試驗（RIHA）是一種簡單實用的實驗室檢測技術，已廣泛應用于人類及動物疾病的田間及臨床檢測。本文概述了RIHA在動物病毒病、細菌病和寄生蟲病診斷方面的應用進展，以期為獸醫(yī)臨床科技工作者更好地應用該法診斷疾病提供參考。

關鍵詞：反向間接血凝試驗；診斷；應用

反 向 間 接 血 凝 試 驗（reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是以紅細胞為載體的間接凝集試驗，即用已知的抗體致敏紅細胞，然后與樣品在適宜的條件下反應。如果樣品中含有目的抗原，則抗原和抗體會發(fā)生特異性結合，紅細胞隨反應的發(fā)生出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。RIHA是一種簡單、實用的實驗室檢測技術，其顯著特點是操作簡便、快速，結果準確，無需特殊儀器和試劑，現(xiàn)場適應性高，已廣泛應用于人類及動物疾病的田間及臨床檢測。本文綜述了RIHA在動物疾病診斷中的應用進展，以期為獸醫(yī)臨床中致力于疾病診斷的科研工作者提供參考。

1　動物病毒病

1.1豬病

RIHA是我國鑒定口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）的行業(yè)標準，該方法能夠快速對FMDV進行初步鑒定。用A、O、C型口蹄疫的豚鼠高免血清致敏豬水皰病病毒（swine vesicular disease virus，SVDV）高免血清抗體球蛋白，用1%戊二醛、甲醛固定的綿羊紅細胞制備的抗體紅細胞，與不同稀釋度的待檢抗原進行RIHA試驗，可在2～7 h內快速區(qū)別診斷豬水皰病和口蹄疫。何永強等［1］通過單克隆抗體斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（McAb Dot-ELISA）和RIHA分別對豬FMDV和SVDV檢測比較。結果表明，McAb Dot-ELISA特異性強，快速簡便，比RIHA更為敏感、穩(wěn)定和直觀。RIHA雖然靈敏度較高，但個別被檢抗原可能在低稀釋度孔內出現(xiàn)非特異性凝集。用豬瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）免疫血清提取IgG并且純化后，致敏綿羊紅細胞，建立RIHA方法，可用于檢測脾臟、淋巴結、扁桃體等病原較集中存在的組織中的CSFV抗原。不足之處在于處理組織病料的方法有差異，所以易對組織中的血細胞造成干擾，從而出現(xiàn)非特異性凝集，導致難以判定結果。吳平等通過單抗致敏的綿羊紅細胞建立的RIHA試驗來檢測豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），結果與血清中和試驗（SN）的符合率為94.4%，并認為RIHA可作為一種PRV的常規(guī)診斷技術。應用豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）IgG，致敏經(jīng)雙醛一次固定的綿羊紅細胞，可直接檢查樣品中的RV。何孔旺等認為RIHA試驗能在1.5～2 h內直接從糞便樣品中檢測出RV抗原。應用RIHA試驗檢側日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），對感染鼠的腦檢測敏感性可達1：1 000以上，具有較高的特異性和檢出率，可在3 h內得到結果。黃志鑫等采集大約、長白、杜洛克和漢普夏等品種的豬血清樣品87份，應用RIHA試驗檢測豬源乙型肝炎病毒抗原（HBsAg），結果檢出陽性3份，陽性率為3.4%，具有較好的特異性和敏感性。

1.2羊病

國內外已有研究人員成功建立了檢測山羊痘病毒（Coatpoxvirus，GPV）的RIHA方法，其不僅可以檢測組織病料中的GPV，而且還可以檢測感染細胞培養(yǎng)物中的GPV。用致敏的綿羊紅細胞可以診斷山羊痘，其中綿羊紅細胞的致敏方法有多種。Rao等［2］應用戊二醛或丹寧酸進行綿羊紅細胞致敏試驗，結果在綿羊痘的診斷中取得較好的效果。王開功等［3］、陳伯祥等［4］以兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞來檢測GPV抗原，并在貴州省疫區(qū)進行了現(xiàn)場山羊痘待檢抗原檢測，結果顯示RIHA方法較瓊脂擴散試驗（AGP）更敏感，表明其建立的方法可用于山羊痘的診斷和流行病學檢測，是一種靈敏、操作簡單、快速的檢測方法。陳燕軍用RIHA試驗對羊傳染性膿皰病毒（Contagious ecthyma virus，CEV）進行了研究，證實了該方法的可行性和特異性。

1.3兔病

孫智鋒等將抗兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）的 AA8-1和CG4-1兩株單抗分別致敏雙醛化人紅細胞，混合后建立了單抗反向間接血凝（McAb-RIHA）方法。其敏感性較常規(guī)血凝試驗（HA）高256倍，最小檢出量為0.214 ng/mL。此法在感染兔的心、肝、脾、肺、骨髓、血液等組織中的RHDV檢出率均為100%；在脊髓、淋巴結、肌肉等組織中的檢出率分別為62.5%、58.3%和37.5%。HA的檢出率除在肝中為100%外，其余均低于McAb-RIHA。該方法不能檢出脊髓、淋巴結和肌肉樣品中的病毒抗原。

1.4禽病

趙新柳應用RIHA檢測雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）。結果表明：用純度過高的抗原制備的高免血清致敏紅細胞后，檢測IBV的敏感度反而下降；而用聚乙二醇（PEG）將病料濃縮后，IBV檢出率明顯提高。畢玉霞［5］認為RIHA可用于檢測IBV抗原，但可靠性不及SN。樊曉京等［6］應用反向間接血凝抑制試驗（RPHI）檢測雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD）血清抗體，得到了滿意的效果。用RPHI和AGP兩種方法同時測定67份雞血清樣品，其中用AGP檢出22份陽性，檢出率為32.8%；用RPHI檢出62份陽性，檢出率為92.5%。在用AGP檢出的22份陽性血清中，用RPHI亦均檢測為陽性；而AGP檢測陰性的45份血清中，用RPHI卻檢出40份陽性。因此RPHI的檢出率比AGP高約60%。Deng等的研究報道證實，用RIHA法檢測鴨瘟病毒（Duck Plague Virus），3 h后可判讀結果。該方法操作簡便，不需昂貴的設備試劑，致敏細胞可長期保存，只是敏感性較低，不適合少量DPV檢測。對于DPV的定性檢測來說，當感染病鴨大量排毒而使送檢組織中存在大量病毒時，RIHA方法足夠敏感，具有實用價值。徐為燕等應用RIHA檢測鵝胚尿囊液中的鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV），郭玉璞等對此法做了進一步完善。孫懷昌等將用純抗病毒單抗IgG致敏鵝或綿羊紅細胞建立了RIHA試驗，并對提純抗GPV抗原進行了檢測，結果顯示最低檢出濃度分別為34 ng/mL和26 ng/mL；在試驗感染鵝胚尿囊液、發(fā)病雛鵝組織及糞便中的檢出率分別為100%（10/10）、81%（27/33）和91%（21/23）。結果還顯示，該方法可對番鴨細小病毒（MDPV）、雞新城疫病毒（NDV）、豬細小病毒（PPV）及犬細小病毒（CPV）進行鑒別診斷。該方法相對簡單，適用于大批量檢測GPV感染樣品。

1.5犬病

丁壯等應用RIHA檢測犬血清，發(fā)現(xiàn)乙肝表面抗原（HBsAg）陽性率為14.67%（11/75），再用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）復檢，結果兩者的陽性符合率高達92%，陰性符合率為100%。該研究對2 431份軍犬血清進行了流行病學調查，發(fā)現(xiàn)RIHA和ELISA的HBsAg陽性符合率為89.2%，陽性率為6.64%（157/2431）。

2　動物細菌病

2.1鼠疫

鼠疫（Pestis）是嚙齒動物和蚤把鼠疫桿菌（Yersinia pestis）傳給人和動物的一種特殊的人獸共患病。王祖鄖等［7］對比鼠疫RIHA與鼠疫細菌培養(yǎng)兩種方法的檢菌結果，發(fā)現(xiàn)動物和人被鼠疫桿菌感染后，鼠疫RIHA的陽性率（100%）明顯高于細菌培養(yǎng)（87%）；對腐敗材料中鼠疫菌的檢測，RIHA診斷效果明顯優(yōu)越于細菌培養(yǎng)，其在細菌培養(yǎng)陰性的情況下，仍能檢出鼠疫桿菌抗原。RIHA在鼠疫診斷中，具有敏感、簡便和快速的特點，有助于及時確定疫源的存在和對疫情的判定，在實際工作中便于應用和推廣，有望成為鼠疫實驗室診斷標準之一。李存香等［8］同時用膠體金免疫層析法（GICA）、RIHA和細菌分離培養(yǎng)法平行檢測6株疑似鼠疫樣本，結果均為陽性。RIHA檢測只能做追溯診斷或提供間接診斷依據(jù)。它可檢查活菌、死菌，以及腐敗材料中的細菌，甚至在腐敗1年后的材料中仍可獲得陽性結果，對判定鼠疫流行和追溯疫源有一定意義。用該方法判定結果最短需2 h，還需要有一定的技術要求，否則容易出現(xiàn)非特異性凝集。

2.2細菌毒素

RIHA法能夠檢測出樣品中微量的金黃色葡萄球菌腸毒素，而不需要濃縮樣品浸液。該技術是先將金黃色葡萄球菌各型腸毒素抗血清通過化學試劑吸附或偶聯(lián)于綿羊、雞和人的紅血球表面，然后再加入被檢的含有相應腸毒素的標本，出現(xiàn)血細胞凝集即為陽性。該試驗簡便、快速，檢出靈敏度高，可達1 ng/mL，只需1～3 h即可判定結果。楊連華等［9］應用RIHA技術檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A（SEA）的檢測限為10.4 ng/mL，金黃色葡萄球菌腸毒素C（SEC）的檢測限為12.0 ng/mL。但該方法所用致敏紅細胞抗原或抗體的純度要高，且在檢測中的人為干擾因素較多，因此只能作為一種初步的定性檢測方法。袁萬哲等［10］利用黏附素單因子血清IgG致敏綿羊紅細胞，建立了定量產腸毒素性大腸桿菌黏附素抗原的RIHA試驗。經(jīng)交叉試驗、抑制試驗和敏感性試驗，證實該試驗具有很高的特異性和敏感性，可用于生物制品中黏附素含量的定量。

王開功等［11］采用兔抗魏氏梭菌α-毒素IgG致敏馬紅細胞，建立了RIHA試驗。該診斷試劑與魏氏梭菌標準株的培養(yǎng)上清液發(fā)生特異的凝集反應，在PBS緩沖液中不自凝，與其他致病菌培養(yǎng)上清無交叉反應。對現(xiàn)場分離樣品的檢測結果表明，該方法與其生化試驗結果的符合率為97.2%，可用于魏氏梭菌病的快速臨床診斷。馬鶴松等為快速特異診斷水貂肉毒梭菌中毒，進行了水貂實驗性肉毒中毒的RIHA診斷試驗。RIHA是較理想的診斷水貂C型肉毒中毒的手段，具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點，不僅可在致死貂尸體上取料確診，還可將有臨床癥狀表現(xiàn)的未致死病貂處死后取料診斷。鄭慶端等應用RIHA試驗，對人工感染豬丹毒發(fā)病豬進行檢測，獲得較好的結果。其中，耳血的檢出率為85.7 %，發(fā)病死亡豬脾臟的檢查出率為100%。

3　動物寄生蟲病

3.1弓形蟲病

使用弓形蟲蟲體抗原或者排泄分泌抗原作為診斷抗原檢測血清抗體時，由于抗原的復雜性和非特異性，檢測結果往往出現(xiàn)假陽性。為了避免這一現(xiàn)象出現(xiàn)，研究者通過制備弓形蟲特異性單克隆抗體作為檢測抗體，建立了檢測血液中循環(huán)抗原（CAg）的McAb-RIHA試驗。同時，對于有免疫缺陷的弓形蟲感染者來說，循環(huán)抗原檢測是唯一有效的血清學檢測手段。郭志剛等利用單克隆抗體建立了McAb-RIHA試驗，它檢測出弓形蟲速殖子可溶性抗原的最低含量為5 μg/mL，也可檢測到弓形蟲QHO株速殖子感染綿羊和家兔2～6 d后血清中的CAg。杜重波等研制的抗弓形蟲McAb-RIHA診斷試劑，可檢測血清弓形蟲CAg，具有診斷弓形蟲急性或活動性感染的價值，可用于弓形蟲病的早期診斷、流產病因學調查和流行病學調查。鞏薇等［12］認為現(xiàn)有的RIHA診斷試劑盒主要用于大家畜的診斷，對小鼠的效果不太好，因此在今后對嚙齒類實驗動物的弓形蟲檢測時應考慮到這一問題。

3.2旋毛蟲病

黃美芳等報道應用McAb-RIHA檢測豬旋毛蟲病的CAg取得了成功。試測的17例旋毛蟲病人中，9例為陽性，應用McAb-RIHA檢測CAg與病原學檢查的符合率為52.9%。

3.3血吸蟲病

李劍瑛等［13］采用McAb-RIHA雙盲法測定正常人與各種類型血吸蟲病人血清，同時進行交叉反應與重復性試驗。結果顯示：用McAb-RIHA檢測正常人血清的假陽性率為2.17%；對急性、慢性及晚期血吸蟲病人檢測的陽性率分別為99.39%、84.00%、28.57%，與糞檢陽性病人的陽性符合率為84.00%。急性血吸蟲病人體內循環(huán)抗原含量高于慢性血吸蟲病人及晚期血吸蟲病人，反應滴度的平均幾何數(shù)均為慢性血吸蟲病人的13.3倍、晚期血吸蟲病人的36.4倍；而不同感染度的慢性血吸蟲病人體內循環(huán)抗原的滴度與其糞中的蟲卵數(shù)量無明顯關系。這證明McAb-RIHA檢測日本血吸蟲循環(huán)抗原有較好的敏感性和特異性。

3.4伊氏錐蟲病

葉萬祥等在建立的檢側伊氏錐蟲CAg的McAb-RIHA基礎上，又建立了檢側伊氏錐蟲抗體的單克隆抗體-反向間接血凝抑制試臉（McAb-RIHI）。用該法檢查實驗感染家兔的系列血清和疫區(qū)水牛血清，并與目前常規(guī)使用的間接血凝（IHA）比較，結果較滿意。

3.5豬囊尾蚴病

李瑩等［14］應用RIHA試驗檢測豬囊尾蚴循環(huán)抗原，探討檢出量與蟲體密度及發(fā)育程度關系，為豬囊尾蚴病的診斷研究提供依據(jù)。張達琳等［15］用鉻離子-單克隆抗體（Cr+++-McAb）鞣酸法致敏綿羊紅細胞做RIHA試驗，檢測囊蟲病患者血清中的CAg。該試驗敏感性較好，可能是由于Cr+++和鞣酸的作用，使McAb更易吸附在血球上，使得該方法簡便易行，快速穩(wěn)定，在囊蟲病的診斷和療效考核方面有一定的應用價值。

3.6包蟲病

李豫青等［16］應用RIHA試驗測定包蟲病患者血清中總IgE水平取得較好結果，可為包蟲病的臨床診斷和療效考核提供依據(jù)。

4　前景與展望

RIHA試驗既可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質成分。最常用的紅細胞為綿羊、家兔、雞的紅細胞及O凝型人紅細胞。新鮮紅細胞能吸附多糖類抗原，但吸附蛋白質抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3 d。為此，一般在致敏前先將紅細胞醛化。醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質抗原或抗體的能力，可長期保存而不溶血。RIHA所需設備簡單，操作簡便，只需在V型96孔微量反應板上進行，結果易判定，特異性和重復性良好，有很好的實用價值，在3 h內即可做出診斷。由于RIHA具有特異性強、靈敏度高和便于操作等優(yōu)點，適用于臨床診斷和對少量樣品的檢測，易于在動物疾病診斷、生物制品研制和廣大基層養(yǎng)殖中推廣應用，具有廣泛的應用前景。

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（責任編輯：朱迪國）

Progress on the Application of Reverse Indirect Hemagglutination Test in the Diagnosis of Animal Diseases

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Wang Yan1，Xie Jinwen1，Mo Ling1，Shen Zhiqiang1
（1. Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600；2. Binzhou Bio-carrier Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600）

Abstract：Reverse indirect hemagglutination test（RIHA）is a simple and practical laboratory testing technology，which has been widely used in the field of human and animal diseases and clinical detection. The progress on the application of RIHA in the diagnosis of animal virus diseases，bacterial diseases and parasitic diseases was summarized， to provide reference for clinical veterinary science and technology workers.

Key words：RIHA；diagnosis；application

中圖分類號：851.3

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）06-0055-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.017

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系毛皮動物創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-18-011-15）