HSPC238在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)與意義①

鐘裕恒　黃　湘　陳敬林　譚家余　米賢軍　劉祥玉

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院　南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院，中山528403)

HSPC238在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)與意義①

鐘裕恒黃湘②陳敬林②譚家余③米賢軍④劉祥玉④

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院，中山528403)

①本文為本文為廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(A2013875)及國家自然科學(xué)基金 (81101534) 資助。

②南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，中山528403。

③南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院中心ICU,中山528403。

④南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院病理科,中山528403。

[摘要]目的：檢測HSPC238在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)。方法：收集76例宮頸癌、105例CIN及28例正常宮頸標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測HSPC238的表達(dá)，比較不同組織中HSPC238表達(dá)的差異。結(jié)果：正常組織和癌組織中的HSPC238的表達(dá)強(qiáng)度無顯著差異(Z=-0.242，P>0.05)宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ)與正常組織有顯著差異(χ2=19.159，P<0.01)，并且發(fā)現(xiàn)HSPC238的表達(dá)與CIN的分級(jí)存在顯著相關(guān)性，隨著CIN級(jí)別升高，染色程度降低(rs=-0.327，P<0.01 )。結(jié)論：HSPC238的低表達(dá)與宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能有一定關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]HSPC238;宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變，免疫組化

HSPC238是由人類基因LOC51255編碼的，含153個(gè)氨基酸的C3HC4型鋅指蛋白(hypothetical protein LOC51255，HSPC238，RN181，NP_057578)。迄今為止，HSPC238的功能知之甚少。Brophy等人在2008年首次發(fā)現(xiàn)，它具有E3泛素蛋白連接酶活性[1]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，不論在體內(nèi)還是體外，HSPC238均可以抑制肝癌細(xì)胞的生長[2]。

肝癌的發(fā)展大部分經(jīng)歷肝炎→肝硬化→肝癌的三步曲，而宮頸癌患者的發(fā)病過程也是從宮頸炎→宮頸上皮內(nèi)瘤變→宮頸癌的過程；此外，HBV為肝癌發(fā)生演變的主要病因之一[3]，而HPV也被認(rèn)為是宮頸上皮內(nèi)瘤變惡性轉(zhuǎn)化的必要因素之一[4]。肝癌與宮頸癌進(jìn)展演變的這些相似性使我們很好奇具有抑制肝癌細(xì)胞生長作用的HSPC238是否對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有同樣的影響。為了初步探討HSPC238與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性，我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)了解HSPC238在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和宮頸癌組織中的表達(dá)情況，從而為進(jìn)一步研究HSPC238在宮頸癌進(jìn)展中的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病例與標(biāo)本選取2012年1月~2013年1月中山市博愛醫(yī)院病理科保存的病理組織蠟塊，按照《婦產(chǎn)科學(xué)》第七版診斷標(biāo)準(zhǔn)，由南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)專家以雙盲閱片法進(jìn)行病例確診的宮頸癌標(biāo)本76例(32~67歲)、宮頸上皮內(nèi)瘤變105例(CINⅠ50例,CINⅡ30例,CINⅢ25例，年齡23~67歲)作為研究對(duì)象。所有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)?；颊咝g(shù)前均未接受過放射性治療、化學(xué)治療或免疫治療等治療。

1.2試劑與實(shí)驗(yàn)方法宮頸組織標(biāo)本行免疫組織化學(xué)染色(ABC法)。常規(guī)試劑購自上海羅氏公司，包括：二甲苯、梯度酒精、PBS緩沖液、中性樹膠、雙氧水、顯色試劑盒、蘇木素復(fù)染劑、二抗及染色試劑盒等。一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1∶150。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片脫蠟，以枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照,用已知陽性表達(dá)HSPC238的肝組織做陽性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定采用半定量方法，細(xì)胞中見到棕黃色顆粒分布為陽性。根據(jù)染色程度進(jìn)行判斷：0為基本不著色，+為淡著色，++為著色適中，+++為深著色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩獨(dú)立樣本的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，相關(guān)性統(tǒng)計(jì)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)正常組織和宮頸癌組織的染色程度沒有顯著差異(Z=-0.242,P>0.05)，見表1、圖1C、D；正常組織和CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ的染色程度有顯著差異，(χ2=19.159,P<0.01)；并且發(fā)現(xiàn)HSPC238的染色程度與CIN的分級(jí)存在顯著相關(guān)性，隨著CIN級(jí)別升高，染色程度降低(rs=-0.327,P<0.01 )見表2、圖2A~C。

表1正常組織和宮頸癌中HSPC238的表達(dá)

Tab.1Expression of HSPC238 in normal cervical epithelial and cervical cancer

Note：Z=-0.242，P>0.05.

表2不同級(jí)別CIN中HSPC238的表達(dá)

Tab.2Expression of HSPC238 in defferent grades of cervical intraepithelial neoplasia

Note：rs=-0.327,P<0.01，χ2=19.159,P<0.01.

3討論

宮頸癌是威脅女性健康和導(dǎo)致死亡的主要惡性腫瘤之一。Shi等[4]在2012年中國宮頸癌的負(fù)擔(dān)中估算我國宮頸癌新發(fā)病例數(shù)可能會(huì)從2010年的27 000~130 000例/年，將會(huì)逐漸增多到2050年的42 000~187 000例/年。闡明其發(fā)生發(fā)展的機(jī)理是防控和治療宮頸癌的重要環(huán)節(jié)。

HSPC238是新發(fā)現(xiàn)的C3HC4型鋅指蛋白。研究表明鋅指蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，鋅指蛋白的異常與許多人類疾病及癌癥包括宮頸癌的發(fā)生有關(guān),如鋅指蛋白ZNF384，ZEB1,RNF152[5-7]。近些年人工鋅指蛋白的生物學(xué)應(yīng)用受到重視[8]，具有滲透性的人工鋅指蛋白AZPs能作為潛在的蛋白抗病毒藥[9]。越來越多的研究將鋅指蛋白作為癌癥治療的干預(yù)靶點(diǎn)。因此探索HSPC238與宮頸癌演變的相關(guān)性，對(duì)于揭示宮頸癌的發(fā)生機(jī)制和指導(dǎo)治療是具有潛在價(jià)值的。

HPV感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件。E6為HPV基因組3個(gè)功能區(qū)中的一個(gè)亞區(qū)，E6含有結(jié)構(gòu)為Cys-x-x-Cys的鋅指結(jié)構(gòu)[10]，它可通過P53途徑使癌細(xì)胞繞過G1/S和G2/M檢查點(diǎn)，是細(xì)胞永生化及惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[11]，在宮頸癌的演變過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，E6相關(guān)蛋白(E6-AP)具有泛素連接酶作用[12]，可代替MDM2促進(jìn)P53的泛素化降解，解除P53對(duì)細(xì)胞周期蛋白的抑制作用，使細(xì)胞繞過關(guān)鍵周期檢查點(diǎn)轉(zhuǎn)為惡性增殖模式。

新近研究提示，與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的核糖體蛋白R(shí)PS27a可以與MDM2中心的酸性區(qū)域結(jié)合，干擾MDM2的泛素連接酶E3的功能。在應(yīng)激過程中，過表達(dá)RPS27a可明顯抑制MDM2介導(dǎo)的P53的泛素化降解過程，使P53分解減少進(jìn)而引起細(xì)胞周期阻滯[13]。有趣的是，在我們的前期研究中通過酵母雙雜交，激光共聚焦，免疫共沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中HSPC238可以與RPS27a結(jié)合并且低表達(dá)HSPC238可以下調(diào)RPS27a(此部分論文正在投稿中)。由于肝癌和宮頸癌的發(fā)病過程具有相似性，由此，課題組推測在宮頸癌中HSPC238也可以調(diào)節(jié)RPS27a。

本次研究發(fā)現(xiàn)HSPC238的染色程度與CIN的分級(jí)存在顯著相關(guān)性，隨著CIN分級(jí)的升高，HSPC238的表達(dá)率降低，說明HSPC238的低表達(dá)可能有利于宮頸腫瘤的進(jìn)展。但在宮頸癌患者中，該蛋白的表達(dá)率并沒有顯著降低，這種現(xiàn)象可能是由于細(xì)胞耐受造成的,提示HSPC238在宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌中可能起著不一樣的作用。關(guān)于CIN進(jìn)展為宮頸癌的機(jī)理仍是研究的難點(diǎn)。為此，我們?cè)噲D從新的角度研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)理，揭示HSPC238與宮頸癌的關(guān)系。

盡管本課題僅對(duì)HSPC238在宮頸腫瘤組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了初步研究，尚不足以揭示HSPC238在宮頸腫瘤發(fā)生中所起的作用，但結(jié)合課題組的前期研究(部分研究結(jié)果正在撰寫投稿中)，我們推測HSPC238可能通過以下機(jī)制(如圖3)參與宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。即在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中，HSPC238表達(dá)下降，使RPS27a 下調(diào)，于是對(duì)MDM2泛素化降解p53的干擾作用減少，具有抑癌作用的p53水平下調(diào)，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。但HSPC238是否在宮頸腫瘤中起著一種獨(dú)特的作用，是否能通過RPS27a影響E6-AP參與的MDM2-P53通路進(jìn)而影響宮頸腫瘤的生長，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。我們希望此研究能夠?yàn)榻沂緦m頸癌的發(fā)病機(jī)制提供一條新線索。

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[收稿2015-05-26修回2015-07-21]

(編輯許四平)

Expression and significance of HSPC238 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer

ZHONGYu-Heng,HUANGXiang,CHENJing-Lin,TANJia-Yu,MIXian-Jun,LIUXiang-Yu.ThirdClinicalCollegeofSouthernMedicalUniversity,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan528403,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of HSPC238 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.Methods: We collected 76 cases of cervical cancer,105 cases of CIN and 28 cases of normal cervical epithelial.Then we investigated the expression of HSPC238 by using immunohistochemistry and compared the significant differences between them.Results: There was no significant difference in the expression of HSPC238 between the cervical cancer and normal cervical epithelial(Z=-0.242，P>0.05).However,there was significant difference between the cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical epithelial(χ2=19.159，P<0.01)and the expression of HSPC238 was correlated with the grades of CIN.The expression of HSPC238 decreased when the grade of CIN was increasing.(rs=-0.327，P<0.01 ).Conclusion: The low expression of HSPC238 might be correlated with the development of cervical neoplasia.

[Key words]HSPC238；Cervical cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;Immunohistochemistry

通訊作者及指導(dǎo)教師：黃湘(1971年- )，女，博士，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫及產(chǎn)前診斷研究，E-mail:340382761@qq.com。

作者簡介：鐘裕恒(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫研究,E-mail:1119282101@qq.com。

中圖分類號(hào)R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0223-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.017 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.018