熒光PCR法在手足口病腸道病毒EV71型臨床診斷中的意義

柴保山（河南省焦作市第三人民醫(yī)院感染四科，河南 焦作 454000）

?

熒光PCR法在手足口病腸道病毒EV71型臨床診斷中的意義

柴保山
（河南省焦作市第三人民醫(yī)院感染四科，河南 焦作 454000）

【摘要】目的 利用實時熒光PCR檢測EV71型腸道病毒，了解焦作地區(qū)手足口病流行趨勢，并提供防治依據(jù)。方法 采集2014年4月9日至12月16日焦作地區(qū)手足口病患兒肛門拭子407例標本，用實時熒光PCR方法對腸道病毒進行核酸檢測。結(jié)果 檢出腸道病毒EV71 型341例，CoXA16型26例型，腸道病毒通用型40例。結(jié)論 2014年4月至12月焦作地區(qū)手足口病以腸道病毒EV71型為主。實時熒光PCR技術(shù)可以對手足口病的治療及疫情的有效控制提供有力的病原學支持。

【關(guān)鍵詞】手足口病；腸道病毒EV71；柯薩奇病毒A組16型；實時熒光PCR

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是嬰幼兒常見傳染病，多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，少數(shù)病情較重者可并發(fā)無菌性腦（膜）炎、心肌炎等，個別重癥病情進展快，易發(fā)生死亡。其主要病原體是腸道病毒，尤其是由EV71引發(fā)的［1］，病情兇險，病死率較高。因此，宜采用高效、快速、準確的方法進行檢測。熒光PCR技術(shù)特異性強、靈敏快速，能有效縮短檢測時間，對手足口病的治療及疫情的有效控制提供有力的病原學支持?，F(xiàn)將研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料。①樣本采集：2014年4月9日至12月16日手足口病407例。每例采集肛門拭子標本1份并裝在3 mL生理鹽水采樣管中，及時送實驗室檢測。②儀器設(shè)備：美國ABI公司的7500型實時熒光定量PCR儀；江蘇默樂生物科技有限公司的EV71、CoXAl6及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 核酸提?。菏褂猛ㄓ眯湍c道病毒RNA檢測試劑盒對所有樣本進行RNA檢測。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，首先對樣本進行RNA提取后，將所得到的RNA樣本進行熒光PCR檢測。其判斷標準為：EV71病毒Ct值＜35.29并且稱典型擴增曲線的為陽性，當Ct值＞38.46時結(jié)果為陰性；CA16病毒監(jiān)測時，Ct值需＜35.86且具有典型擴增曲線的為陽性，其值＞38.64時為陰性；腸道病毒的Ct值＜35.62并且具有典型擴增曲線的即為陽性，Ct值＞38.16時，結(jié)果為陰性。當Ct值介于二者之間時，需進行二次復(fù)檢，如結(jié)果仍然在這個區(qū)間，則為陽性［2］。

1.2.2 實時熒光PCR反應(yīng)：EV71、CoXA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒說明書操作：①PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系總?cè)莘e為20 μL，內(nèi)含EV71（CoXAl6）RT-PCR buffer 12.5 μL，Taq酶0.5 μL，RT酶0.5 μL，EV引物探針6.5 μL。②探針檢測模式設(shè)置為：VIC/HEX熒光選擇VIC，將Quencher欄和Passive Reference欄選none。③PCR反應(yīng)條件：45 ℃15 min逆轉(zhuǎn)錄，1個循環(huán)；95 ℃變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃10 s'——58 ℃40 s'，40個循環(huán)。④在系統(tǒng)成立，即陰陽性參考均正常的條件下，按試劑公司所給的參考值進行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

病毒核酸檢測結(jié)果：應(yīng)用熒光PCR的方法，對407例臨床樣本進行病毒核酸的檢測，其結(jié)果顯示本次監(jiān)測樣本407例中，陽性率為100%。EV71型341例，占83.7%；CoXA16型26例，占6.3%；通用型6例，占9.8%。以腸道病毒EV71型為主，這與國內(nèi)多個省市手足口病的流行趨勢相符。診斷參照衛(wèi)生部《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識（2011年版）》，均符合手足口病的癥狀。

3 討 論

近年來，我國每年都有大量嬰幼兒患手足口病，多表現(xiàn)為口痛、厭食、手足及口腔內(nèi)出現(xiàn)皰疹或潰瘍，多數(shù)患兒可在一周左右痊愈，但是也有部分兒童會引起心肌炎、肺水腫及腦膜炎等并發(fā)癥［3］，個別重癥兒童由于病情發(fā)展迅速而死亡。目前臨床上尚無對癥治療藥物。

目前我國針對手足口病主要采取早診斷、早隔離、早治療的臨床方案，在診斷時，以觀察臨床表現(xiàn)為主要手段，采用傳統(tǒng)的分離病毒再進行血清中和試驗的方式來進行定型，通常過程需要7～8 h，嚴重耽誤了病情的治療。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)目前已經(jīng)在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用。

通過研究結(jié)果表明，熒光PCR技術(shù)可以有效的滿足目前手足口病的前期診斷工作需要，其在解決了產(chǎn)物污染導(dǎo)致假陽性問題的同時，還可以通過熒光強度進行精確的定量，使得監(jiān)測的靈活度和靈敏度都有著明顯提高［4-6］。使用熒光PCR法進行手足口病的監(jiān)測，從標本處理到結(jié)果只需要3～4 h，極大的節(jié)約了觀察

熒光PCR技術(shù)，實行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴增產(chǎn)物污染的機會，且較常規(guī)RT-PCR，無論從敏感性、特異性與速度上都更具有優(yōu)勢。本院通過熒光實時PCR及時病原確診并給予了正確的治療，手足口病重癥只有1例死亡，病死率明顯降低。鑒于此，本研究認為熒光實時PCR在手足口病的檢測中值得推廣和應(yīng)用。

參考文獻

［1］ 鳴榮，鄧皓輝.陳志鳳，等.廣東東莞市兒童手足口病502例臨床分析［J］.新醫(yī)學，2008，39（12）：792-794.

［2］ 高騫，劉文恩，劉元元，等.熒光PCR法檢測手足口病病原體及其臨床意義［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21（24）：5323-5325.

［3］ 吳旭耀，沈彩燕，李成，等.手足口病患兒EV71的檢測與其臨床分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20（24）：3894-3896.

［4］ 陳祿彪，張廣，錚施巧，等.手足口病病原的熒光PCR法檢測及其臨床特點［J］.新醫(yī)學，2009，40（7）：464-466.

［5］ 陳勉喬，于浩洋，盧秋梅，等.EV71-CA16腸道病毒熒光定量RTPCR診斷試劑盒的研制［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2015，30（6）：27-31.

［6］ 徐昌平，鄭春紅，嚴菊英，等.EV71、CA16和腸道病毒通用型三重熒光RT-PCR 檢測技術(shù)的建立［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學，2016，28（3）：217-220.

中圖分類號：R725.1

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）17-0038-01