蕎麥花葉總黃酮對阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表達的影響

閆曉紅　安可英　毛艷華　宓寶斌　劉　莉

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科,山東　濱州　256603)

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蕎麥花葉總黃酮對阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表達的影響

閆曉紅安可英毛艷華宓寶斌劉莉1

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科,山東濱州256603)

〔摘要〕目的探討蕎麥花葉總黃酮(TFBFL)對阿霉素致心力衰竭大鼠模型心功能及miR133a表達的影響。方法選取Wistar大鼠90只，按隨機數字表達法隨機分為正常對照組、模型組、TFBFL高劑量組(400 mg/kg)，TFBFL低劑量組(100 mg/kg)和卡托普利組(10 mg/kg)，除了正常對照大鼠外，其他四組大鼠予以腹腔注射鹽酸阿霉素建立心力衰竭模型，于造模第4周起予以各組大鼠相應的藥物進行灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃3 w。末次灌胃后采用彩色多普勒超聲診斷儀測定各組大鼠的心功能指標射血分數(EF)短軸縮短分數(FS)；采用酶聯免疫方法檢測各組大鼠動脈血清的腦鈉肽(BNP)含量；采用熒光定量PCR檢測各組大鼠心臟組織miR133a相對表達量。結果①正常對照組大鼠心功能指標EF、FS及miR133a表達水平明顯高于模型組(P<0.05)，而動脈血清中BNP含量較模型組明顯下降(P<0.01)；②經過卡托普利、TFBFL治療后三組大鼠EF和FS較模型組明顯升高(P<0.01)，而三組動脈血清BNP含量明顯低于對照組(P<0.01)，三組間各指標無明顯差異(P>0.05)；③經過卡托普利和TFBFL治療后的三組大鼠心臟組織miR133a mRNA水平明顯升高，與正常對照組比較差異顯著(均P<0.05)，并以TFBFL低劑量組大鼠升高最為顯著；④TFBFL低劑量組大鼠心功能指標及BNP含量改善程度較蕎麥花葉總黃酮高劑量組好，但二者無差異(P>0.05)。結論蕎麥花葉總黃酮能夠明顯提高阿霉素導致的心力衰竭模型大鼠的miR133a相對表達量，改善心功能，但心功能改善與蕎麥花葉總黃酮劑量未見明顯的量效關系。

〔關鍵詞〕蕎麥花葉總黃酮；阿霉素；心力衰竭；心功能；miR133a

1海陽市人民醫(yī)院手術室

第一作者：閆曉紅(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學研究。

心力衰竭多發(fā)于中老年人群，我國心力衰竭患者的發(fā)病率從1990年的0.7%上升至2010年的3.6%，并有逐年上升趨勢〔1〕。導致本病原因以原發(fā)性心肌損害和心臟負荷過重為主。研究發(fā)現〔2〕，從銀杏、黃芩等植物中提取的黃酮類化合物具有較好的降脂、擴血管、抗血栓和抗氧化的作用。但國內外從蕎麥花葉中提取出來的蕎麥花葉總黃酮(TFBFL)對心力衰竭臨床療效的研究報道較少。本文通過觀察心功能指標、血清中腦鈉肽(BNP)及心臟組織微小RNA(miR133a)表達的水平變化，來探究TFBFL對心力衰竭的影響及作用機制。

1資料與方法

1.1動物6周齡Wistar雄性大鼠90只，平均體重(153±14)g，大鼠購于中國科學院上海動物中心(合格證號：D20021024)。

1.2藥品、試劑及儀器TFBFL：將采自于內蒙古庫倫旗的蕎麥花葉研碎物，水浴加熱，收集濾液，3次水浴加熱后合并濾液，采用醇提后，干燥濾液，即得TFBFL，經中國藥科大學藥物研究所鑒定黃酮含量為97.96%；鹽酸阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司產，批號0509E1)；卡托普利片(廣州白云山制藥股份有限公司廣州白云山制藥總廠，批準文號：國藥準字p4021034，2010-07-16)；BNP試劑盒購于賽馳生物公司；Trizol試劑購于美國GIBCO公司；大鼠miR133a核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于美國Promega公司；Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀，購于美國PHILIPS公司，頻率為3～8 mHz小兒心臟探頭。

1.3心力衰竭大鼠模型建立及分組將90只Wistar雄性大鼠按隨機數字表達法隨機分為正常對照組、模型組、卡托普利組(10 mg/kg)、TFBFL高劑量組(400 mg/kg)和TFBFL低劑量組(100 mg/kg)，每組18只。除正常對照組，其他四組大鼠每周一向腹腔注射0.8 mg/L的鹽酸阿霉素1次，第1～3周按3 mg/kg劑量注射，第4～6周按2 mg/kg劑量注射，正常對照組每周周一向腹腔注射等劑量的生理鹽水1次。腹腔注射鹽酸阿霉素第4周同時予以各組大鼠相應的藥物灌胃，正常組和模型組予以10 mg/kg生理鹽水灌胃；卡托普利組予以10 mg/kg卡托普利灌胃；TFBFL高劑量組給予400 mg/kg TFBFL灌胃；TFBFL低劑量組給予100 mg/kg TFBFL灌胃，各組大鼠灌藥治療3 w，灌藥1次/d。采用BL420系統(tǒng)測量左心室功能標志均比正常對照組大鼠低，說明心力衰竭大鼠模型建立成功。

1.4觀察指標及檢測方法

1.4.1各組大鼠心功能測定五組大鼠治療3 w后，用10%水合氯醛將大鼠進行麻醉，胸口備皮，采用Philips-IE33彩色多普勒超聲診斷儀在超聲心動圖下觀察左室長軸切面、短軸二腔面和四腔面的腔室大小以及室壁的運動情況，采用心功能測定軟件包計算和分析射血分數(EF)和短軸縮短分數(FS)，連續(xù)測量3個心動周期，取平均值作為EF及FS值。

1.4.2各組大鼠血液中BNP水平測定麻醉理想后，消毒，無菌操作下打開胸腔，剪開心包，暴露心臟及主動脈，抽取主動脈血5 ml，加入含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的真空管中混勻，采血后，游離心臟，取出心臟浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。動脈血3 000 r/min離心10 min，抽取血清，采用酶聯免疫法(ELISA)測定血清中BNP含量。

1.4.3miR133a mRNA水平的檢測

1.4.3.1總RNA的提取把取出的心臟組織剪碎、研磨，置于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hank液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。實驗操作按產品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的A260/A280確定總RNA純度。

1.4.3.2反轉錄聚合酶鏈反應根據逆轉錄試劑盒要求進行反轉錄反應操作，按照相關文獻資料設計PCR中內參照甘油酯-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和miR133a引物，將RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用，將2 μl Primer mix試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應體系的第一部分，混勻。PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq (2×)10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L)0.4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6.8 μl，總反應體系為20 μl。經過PCR反應條件的優(yōu)化,PCR循環(huán)條件為94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1 min,共35個循環(huán),最后72℃再延伸5 min。miR133a:引物序列：正義：5′-CACCTATGTAAGATCGCTTC-3′；反義：5′-GCACAATCGCCATAATTATCC-3′，產物大小444 bp；GAPDH正義：5′-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3′，反義：5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，產物大小320 bp。

1.4.3.3結果分析PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較miR133a產物條帶的吸光度值，并與GAPDH條帶光密度值比較，計算出miR133a在球囊損傷模型大鼠主動脈組織中mRNA表達含量相對值。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學分析軟件，組間比較進行t檢驗。

2結果

2.1各組大鼠心功能指標比較正常對照組大鼠心功能指標EF%〔(92.36±3.89)%〕及FS%〔(60.15±7.54)%〕明顯高于模型組〔(71.26±4.18)%，(36.48±3.85)%〕(P<0.01)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組大鼠EF%〔(85.32±3.64)%、(80.35±4.84)%、(85.71±4.21)%〕及FS%〔(50.14±6.36)%、(43.36±5.48)%、(49.2±4.59)%〕較模型組升高(P<0.01)，但三組間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TFBFL低劑量組大鼠心功能指標處于一個較高水平，但與TFBFL高劑量組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2五組大鼠心臟組織中miR133a mRNA水平比較正常對照組大鼠心臟組織中miR133a mRNA水平〔(2.85±1.07)%〕明顯高于模型組〔(1.21±0.64)%〕(P<0.05)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組治療后miR133a mRNA水平明顯升高分別為(24.87±6.87)%、(4.78±1.49)%、(112.14±4.57)%，與正常對照組相比較差異顯著(P<0.05)，并以TFBFL低劑量組大鼠升高最為顯著。見圖1。

1正常對照組，2模型組，3TFBFL高劑量組，4卡托普利組，5 TFBFL低劑量組圖1　五組大鼠心臟組織miR133a 表達水平的變化

2.3五組大鼠主動脈血清BNP水平比較正常對照組大鼠動脈血清中BNP含量〔(15.6±3.67)ng/ml〕明顯低于模型〔(45.34±8.74)ng/ml〕(P<0.01)；卡托普利組、TFBFL高、低劑量組〔(18.75±3.48)ng/ml、(29.85±5.64)ng/ml、(27.94±4.67)ng/ml〕與模型組相比明顯下降(P<0.01)，但三組間無差異(P>0.05)；TFBFL低劑量組大鼠動脈血清中BNP含量與TFBFL高劑量組相比較低，但無差異(P>0.05)。

3討論

心力衰竭病情危重、預后差，是心血管疾病的主要死亡原因，嚴重威脅人類生命健康〔3〕。本病主要因原發(fā)性心肌損害及心臟負荷過重為主要基本病因，以呼吸道感染、心律失常為主要誘因〔4〕。阿霉素是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物，廣泛用于對實質性以及血液性惡性腫瘤的治療，但阿霉素具有嚴重的心肌毒性，能夠引起充血性心力衰竭〔5〕。

miR是一類大小為19～25個堿基內源性非編碼RNA，調節(jié)細胞的轉錄，在心血管系統(tǒng)的生理和病理作用有著重要的地位〔6〕，研究表明〔7〕，通過miR133a的表達具有心肌組織特異性，對心力衰竭具有有效的保護作用。正常情況下〔8〕，BNP主要存儲于心室肌內，具有擴張血管、增加排鈉、對抗腎上腺素、腎素-血管緊張素等引起的水、鈉潴留的作用，其分泌量隨著心室充盈壓高低變化，當心室充盈壓升高時，BNP的分泌迅速增加，從而保證心室的搏出量，保證機體的血氧供應量。當心力衰竭時，心室壁張力增加，心室肌應激性增加對BNP分泌，從而導致外周血中BNP含量增加，并且其增高的程度與心衰的嚴重程度呈正相關，因此血中BNP常常用來評價心衰的進程以及判斷預后的指標〔9〕。本研究結果也證實了上述理論觀點。

黃酮類化合物是以兩個酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子連接而成的一系列化合物，常常連接有酚羥基、甲氧基等功能團。從蕎麥花葉中提取出來的總黃酮是一種很強的抗氧化劑，能夠有效清除氧自由基，防止細胞退化，能夠改善血液循環(huán)，降低血膽固醇含量，具有擴張血管、防止血栓形成，有效降低心臟前后負荷，預防和有效治療心力衰竭〔10〕。卡托普利為血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，是臨床中治療心力衰竭的標準用藥〔11〕。本研究結果說明TFBFL能夠上調心力衰竭大鼠心臟組織miR133a的表達，對心力衰竭起到保護性作用，改善心肌功能，降低水、鈉潴留和心臟負荷，增加EF及FS，這可能與下調心室肌對BNP的分泌有關〔12〕。雖然低劑量的TFBFL能夠顯著升高心衰大鼠心臟組織miR133a表達，但心功能指標的改善程度與TFBFL的劑量無明顯的量效關系。

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〔2015-03-28修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R54

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.016