大鼠CB1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)CaSki細(xì)胞凋亡的影響

嚴(yán)磊，李晶，趙婷婷，王會(huì)娟，王蕾，賴(lài)國(guó)旗,3*

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶　400016；2. 重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶　404120；

3.重慶市嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，重慶　400016)

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大鼠CB1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)CaSki細(xì)胞凋亡的影響

嚴(yán)磊1，李晶2，趙婷婷1，王會(huì)娟1，王蕾1，賴(lài)國(guó)旗1,3*

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶400016；2. 重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶404120；

3.重慶市嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，重慶400016)

【摘要】目的構(gòu)建大鼠CB1 (rCB1)基因真核表達(dá)載體，檢測(cè)rCB1基因在細(xì)胞中的表達(dá)，研究rCB1對(duì)人宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的影響。方法從大鼠腦組織中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增rCB1基因, 通過(guò)酶切、純化、連接PCR純化產(chǎn)物與pCDNA 3.1(+)質(zhì)粒，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-rCB1。脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染到HEK293和CaSki細(xì)胞，Western blot及細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦方法檢測(cè)rCB1的表達(dá)及定位，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rCB1、Bcl-2、Bax、Bad表達(dá)。結(jié)果酶切重組質(zhì)粒獲得5300 bp的載體片段和1500 bp的目的片段，測(cè)序結(jié)果和rCB1基因序列(NM012784.4)一致。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后， rCB1在HEK293細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后， rCB1使細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；rCB1基因上調(diào)Bax、Bad的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2的表達(dá)，與空白組比較，其差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-rCB1真核表達(dá)載體， rCB1表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，rCB1可以明顯促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是上調(diào)Bax、Bad和抑制Bcl-2表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】CB1基因；HEK293細(xì)胞；CaSki細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

大麻素是從印度大麻(Cannabissativa)里發(fā)現(xiàn)的一組萜酚類(lèi)化合物，存在于動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)里[1,2]。大麻類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮生物作用的基礎(chǔ)是大麻受體，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞型： 1型大麻受體(cannabinoid receptor 1，CB1)[3]和2型大麻受體(cannabinoid receptor 2，CB2)[4]，其中CB1受體主要分布于腦、脊髓與外周神經(jīng)系統(tǒng)中，故又稱(chēng)中樞型大麻素受體。腦內(nèi)的CB1受體主要分布于基底神經(jīng)節(jié)(包括黑質(zhì)、蒼白球和外側(cè)紋狀體)、海馬CA錐體細(xì)胞層，小腦和大腦皮質(zhì)。通過(guò)激活CB1受體可以降低神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺和GABA)的釋放，調(diào)節(jié)、參與記憶、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)等活動(dòng)的控制[5]。大鼠實(shí)驗(yàn)表明，大麻素受體在子宮組織中也有廣泛分布[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，大麻素對(duì)乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等具有抑制作用，在腫瘤組織中，增加大麻素受體在組織中的分泌可以選擇性抑制細(xì)胞的惡性增殖[7]。我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第二，基因?qū)Ρ确治霰砻鳎祟?lèi)CB1基因與大鼠的CB1基因序列存在很高的同源性。鑒于大鼠腦組織獲取方便，本研究首先構(gòu)建大鼠CB1真核表達(dá)載體，隨后分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞與宮頸癌CaSki細(xì)胞，研究rCB1的細(xì)胞定位和rCB1對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的影響以及作用機(jī)制，其結(jié)果對(duì)大麻素治療宮頸癌具有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠3只，雄性，體重 6.5 ～7.0 g，1日齡。購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 [SCXK(渝)2012-0001]。大鼠的組織取材在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行 [SYXK(渝)2012-0001]。

1.1.2材料和主要試劑

pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、HEK293細(xì)胞、宮頸癌CaSki細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司； RT-PCR試劑盒、T載體連接試劑盒、T4DNA連接酶試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)菌、DL2000 DNA maker、DL5000 DNA maker、DL1000 DNA maker、Taq DNA多聚酶、凝膠回收試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI，BamHI)購(gòu)自美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司產(chǎn)品；兔抗大鼠CB1抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bad多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abgent; DyLight 549標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、藻紅蛋白標(biāo)記的膜聯(lián)素 (phycoerythrin conjugated annexin Ⅴ, annexin V-PE)/7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、防熒光淬滅劑購(gòu)自碧云天公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Coulter；GeneGnome5化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó) Syngene；iQ5型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠CB1基因NM_012784.4序列設(shè)計(jì)引物。其上游引物：5′-CG GGATCCGCCACCATGAAGTCGATCCTAGATG-3′；下游引物：5′-GGAATTCCTTTTTCTGTGCAGCCACAA-3′。其中，分別在上游和下游引物的5′端加上了EcoRI，BamHI酶切位點(diǎn)，引物由上海Invitrogen公司合成(見(jiàn)表1)。

表1qRT-PCR相關(guān)引物

Tab.1Primers applied in the quantitative RT-PCR analysis

基因Genes上游引物(5’-3’) Senseprimer 下游引物(3’-5’) Antisenseprimer rCB1CTACTGGTGCTGTGTGTCATCGCTGTCTTTACGGTGGAATACBcl-2ATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGCATCCCAGCCTCCGTTATCBaxGCTGTTGGGCTGGATCCAAGTCAGCCCATCTTCTTCCAGABadCCAGTGAGCAGGAAGACTCGGTAGGAGCTGTGGCGACTGAPDHGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCATGGACTGTGGTCATGAGTCCT

1.2方法

1.2.1rCB1克隆和pcDNA3.1(+)-rCB1真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)從1日齡SD大鼠腦組織中提取大鼠總RNA。按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為SD大鼠腦組織cDNA文庫(kù)，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增rCB1基因，條件為：50 μL體系；94℃ 5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃ 45 s，循環(huán)30次后72℃，7 min。PCR產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳,按凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。

用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI酶切rCB1片段和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，凝膠電泳后按凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收純化。按T4DNA連接酶試劑盒將含rCB1片段連接到pcDNA3.1(+)酶切片段上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，用含Amp的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，用含Amp的LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37℃，搖菌培養(yǎng)16 h。菌液按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，酶切鑒定; 同時(shí)，質(zhì)粒DNA送上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2HEK293細(xì)胞的pcDNA3.1(+)-rCB1轉(zhuǎn)染

將HEK293細(xì)胞接種于35 mm含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞的匯合率在50%～70%時(shí)，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染時(shí)將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合, 室溫下靜止 30 min后滴加在用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞上，6 h 后更換含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后吸去培養(yǎng)基，收獲細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.3Western blot檢測(cè)rCB1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染48 h后的HEK293細(xì)胞，裂解，提取蛋白。蛋白樣品在100℃變性10 min，取5 μL蛋白樣本上樣，10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂牛奶的TBST中封閉2 h，兔抗大鼠CB1抗體(1∶300)4℃孵育過(guò)夜，與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光激光掃描共聚焦檢測(cè)rCB1在293細(xì)胞中的定位

取轉(zhuǎn)染48 h后的HEK293細(xì)胞爬片，冰甲醇處理15 min，加3% H2O2，20 min；5%胎牛血清封閉1 h，兔抗大鼠CB1抗體(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶50) 37℃孵育2 h，DAPI染色 5 min，防熒光淬滅劑封片，激光掃描。

1.2.5CaSki細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

pcDNA3.1(+)-rCB1質(zhì)粒按1.2.2方法轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)胰酶消化，PBS清洗，離心，PBS重懸后，按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.6rCB1及凋亡相關(guān)因子在CaSki細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)

pcDNA3.1(+)-rCB1質(zhì)粒按1.2.2方法轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞。

(1)Western blot: 經(jīng)超生裂解，100℃變性后于10% SDS-PAGE電泳90 min，轉(zhuǎn)膜1 h，在5% BSA封閉液中封閉2 h。以兔抗大鼠CB1抗體(1∶500)、兔抗人Bcl-2抗體 (1∶1000)、兔抗人Bax抗體 (1∶1000)、兔抗人Bad抗體 (1∶1000) 4℃孵育過(guò)夜，加辣根酶過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育2 h，ECL法顯影。

(2)RT-PCR: 按RNA提取試劑盒提取總RNA，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以所獲cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明操作， PCR反應(yīng)條件：25 μL體系，95℃，10 min; 94℃ 20 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s，40 cycles。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt分析，ΔΔCt=(Ct目的基因 - Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組 - (Ct目的基因 - Ct內(nèi)參)空白組，相對(duì)定量 (relative quantification，RQ)，以RQ實(shí)驗(yàn)組=2 - ΔΔCt，RQ對(duì)照組=1計(jì)算。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增rCB1及載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，條帶大小在1.5 kb。用BamHI和EcoRI酶切pcDNA3.1(+)-rCB1重組質(zhì)粒，切出1.5 kb的rCB1片段和5.3 kb的載體片段。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果與預(yù)期一致。

注：M：D2000；1：rCB1 PCR結(jié)果?！　D1　rCB1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Note. M：D2000；1：The results of rCB1 by PCR. 　　Fig.1　The results of rCB1 PCR products detected by agarose gel electrophoresis

注：M：D5000; 1：pcDNA3.1(+)-rCB1 BamHI、EcoRI酶切產(chǎn)物?！　D2　pcDNA3.1(+)-rCB1雙酶切鑒定結(jié)果M：D5000; 1：The products of pcDNA3.1(+) -rCB1 detected by double enzyme digestion with BamH I and EcoR I.　　Fig.2　The results of pCDNA3.1(+)-rCB1 by double enzyme digestion

2.2rCB1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)與定位

pcDNA3.1(+)-rCB1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)rCB1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖3示，rCB1轉(zhuǎn)染組在50×103處出現(xiàn)一條蛋白帶。細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦(549 nm波段)檢測(cè)rCB1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。如圖4示，紅色為rCB1蛋白表達(dá)且分布于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果與預(yù)期一致。

圖3　rCB1 Western blot結(jié)果　　Fig.3　The results of rCB1 detected by Western blot

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

pcDNA3.1(+)-rCB1轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)rCB1轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖5所示，與未轉(zhuǎn)染組比較，rCB1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率(32.99±3.25)%大于對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率(13.11±0.32)%，兩組之間差異有顯著性(P<0.05)。

2.4rCB1、Bcl-2、Bax、Bad在CaSki細(xì)胞的表達(dá)

pcDNA3.1(+)-rCB1轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后，Western blot結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組比較，rCB1組的Bax、Bad表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組比較,rCB1組中的Bax、Bad的mRNA表達(dá)高于空白組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA的表達(dá)低于空白組(P<0.05)。

3討論

20世紀(jì)90年代初，人類(lèi)發(fā)現(xiàn)大麻素CB1受體并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)CB1受體由473個(gè)氨基酸/7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，屬于G蛋白偶聯(lián)受體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CB1受體主要來(lái)源于神經(jīng)細(xì)胞，CB1受體幾乎都能與所有的大麻類(lèi)物質(zhì)結(jié)合，作為大麻素的作用受體，其生物作用是調(diào)節(jié)化學(xué)遞質(zhì)的釋放[3]。

目前關(guān)于人CB1受體生理功能和藥物活性的研究已有大量報(bào)道，CB1受體在神經(jīng)退行性疾病、鎮(zhèn)痛、精神性疾病、心血管疾病、糖尿病、眼科疾病、調(diào)節(jié)胃腸道系統(tǒng)等治療中具有重要的作用[9-11]。大麻素與CB1受體結(jié)合后通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤血管生成等作用對(duì)包括乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、皮膚癌、甲狀腺癌和胰腺癌等腫瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用[7]。

注：A: DAPI B: 紅色熒光 D: 復(fù)合圖?！　D4　轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-rCB1 后HEK293細(xì)胞的免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦觀察Note. A: DAPI; B: Red fluorescence; D: Composite diagram.　　Fig.4　Immunofluorescence and laser scanning confocal microscopic observation on HEK293 cells transfected with pcDNA3.1(+)-rCB1

圖5　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果　　Fig.5　Apoptosis in CaSki cells determined by flow cytometry

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。Note. *P<0.05, compared with the control group.　　圖6　Western blot檢測(cè)rCB1、Bcl-2、Bax、Bad蛋白表達(dá)結(jié)果　　Fig.6　Expressions of rCB1, Bcl-2, Bax, and Bad proteins detected by Western blot

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05?！　D7　熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、Bad的mRNA表達(dá)結(jié)果Note. *P<0.05, compared with the control group.　　Fig.7　Expression levels of CB1, Bcl-2,Bax, and Bad mRNA measured by qRT-PCR

通過(guò)分析人類(lèi)CB1基因和大鼠rCB1基因的核酸序列，發(fā)現(xiàn)基因序列相似性達(dá)99%。Sordelli 等[6]發(fā)現(xiàn)，CB1受體和CB2受體在大鼠子宮內(nèi)有分布，影響胚胎的植入。Fonseca 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，給予藥物激動(dòng)CB1受體，CB1可誘導(dǎo)大鼠子宮蛻膜細(xì)胞的凋亡，Sanchez[13]和Gentilini[14]的研究也發(fā)現(xiàn)CB1受體與人、小鼠子宮內(nèi)膜異位及細(xì)胞凋亡存在關(guān)聯(lián)。馮睿等[15]構(gòu)建了rCB1-EGFP融合蛋白真核表達(dá)載體。然而，有關(guān)rCB1的生物活性報(bào)導(dǎo)還是很少。

宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康，每年全世界約有 51 萬(wàn)新發(fā)病例。在中國(guó)每年有10 萬(wàn)新發(fā)病例, 約占世界宮頸癌新發(fā)病例的 1/5[16-18]。宮頸癌按病理學(xué)分為三種：鱗癌、腺癌和腺鱗癌。對(duì)宮頸癌組織標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，99%以上的宮頸癌有人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染，HPV-16感染引起的宮頸鱗癌占50-60%[19-21]。在現(xiàn)有的宮頸癌細(xì)胞株中，CaSki細(xì)胞是HPV-16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞株，以CaSki細(xì)胞為模型，探索治療宮頸癌的新基因藥物，對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。

本研究首先根據(jù)大鼠CB1受體的分布，取大鼠腦組織后剝離腦膜與腦血管，分離大鼠腦組織海馬區(qū)，從海馬區(qū)獲取RNA可保障rCB1高拷貝，并構(gòu)建鼠源CB1基因構(gòu)建真核表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的rCB1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞，研究rCB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，rCB1能夠表達(dá)于HEK293細(xì)胞中且表達(dá)于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中，這與Geiger等[22]研究人CB1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)位置一致。利用構(gòu)建成功的rCB1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rCB1可以誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CaSki細(xì)胞中bcl-2、bax、bad的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而表明rCB1通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡因子bcl-2家族中bax、bad的表達(dá)和下調(diào)了bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了rCB 1真核表達(dá)載體，并在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)rCB1能夠誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是上調(diào)bax、bad和下調(diào)bcl-2的表達(dá)。研究結(jié)果提示rCB1對(duì)宮頸癌具有治療作用，有望取代人的CB1功能。

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研究報(bào)告

Construction of expression vector containing rat rCB1 gene and

its influence on the apoptosis in human cervical cancer CaSki cell line

YAN Lei1, LI Jing2, ZHAO Ting-ting1, WANG Hui-juan1,WANG lei1, LAI Guo-qi1

(1. Laboratory of Animal Center of Chongqing Medical University, Chongqing 400016；

2. Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing 404120；

3. Chongqing Engineering Research Center on Rodent Laboratory Animals, Chongqing 400016)

【Abstract】ObjectiveTo construct rCB1 gene eukaryotic expression vector, detect its expression in the cell, and explore its influence on apoptosis in human cervical cancer CaSki cells. Methods The total RNA was extracted from rat brains. The rCB1gene was amplified by RT-PCR. The pcDNA3.1(+)-rCB1 was constructed by enzyme digestion, purification, bind the PCR purification products and pcDNA3.1 (+) DNA. The pcDNA3.1 (+)-rCB1 plasmid was transfected into HEK293 and CaSki cells by liposomes. The expression and localization of rCB1 were detected by Western blot and immunofluorescence combined with confocal laser scanning microscopy. The apoptosis rate of CaSki cells was detected by flow cytometry. The expression of rCB1, Bcl-2, Bax and Bad was detected by Western blot and real-time fluorescence quantitative RT-PCR (qRT-PCR). ResultsThe 5300 bp pcDNA3.1(+) and 1500 bp rCB1 were obtained after digesting the pcDNA3.1(+)-rCB1. The result of sequencing was in agreement with the sequence of rCB1 gene (NM012784.4). The rCB1 expressed in the membrane and cytoplasm when pcDNA3.1 (+)-rCB1 plasmid was transfected into HEK293 cells. The apoptosis rate of rCB1 group was increased compared with the blank group when pcDNA3.1 (+)-rCB1 plasmid was transfected into CaSki cells (P<0.05). Compared with the blank group, rCB1 gene upregulated the expression of Bax and Bad, and suppressed the expression of Bcl-2. The statistical difference was significant (P<0.05). ConclusionsThe pCDNA3.1(+)-rCB1 eukaryotic expression vector is constructed successfully. It is found that rCB1 is expressed in membrane and cytoplasm of HEK293 cells. rCB1 can significantly promote the apoptosis in cervical cancer CaSki cells by up-regulating the expression of Bax and Bad, and down-regulating the expression of Bcl-2 as well.

【Key words】rCB1; HEK293 cells; CaSki cells; Cell apoptosis

[收稿日期]2014-11-18

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.010

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847(2015) 02-0153-06

[通訊作者]賴(lài)國(guó)旗(1964-)，女，教授，博士。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: a68895078@21cn.com。

[作者簡(jiǎn)介]嚴(yán)磊(1985-)，男，碩士研究生。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。E-mail: 985466685@qq.com。

[基金項(xiàng)目]重慶市教委自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KJ111802)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2012-1-096)；重慶市高等教育教學(xué)改革研究重點(diǎn)項(xiàng)目(132128、133309)；重慶萬(wàn)州區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(201203055)；重慶市應(yīng)用開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013yykfC10005)。