番茄細菌性葉斑病菌的拮抗菌篩選、鑒定及其拮抗性能評價

馮中紅，王玉琴，楊成德，薛莉，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅省草業(yè)工程實驗室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)

番茄細菌性葉斑病菌的拮抗菌篩選、鑒定及其拮抗性能評價

馮中紅，王玉琴，楊成德*，薛莉，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅省草業(yè)工程實驗室,

中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州730070)

摘要：采用含菌平板抑菌圈測定法，從120株高寒草地牧草內(nèi)生細菌中分離篩選到一株對番茄細菌性葉斑病拮抗能力較強的菌株264ZY7，其抑菌圈直徑為1.22 cm。264ZY7菌體短桿狀，大小為1.534 μm×0.571 μm~3.210 μm×0.781 μm，革蘭氏陽性菌，根據(jù)形態(tài)特征，并結(jié)合16S rDNA和gyrB基因序列相似性分析，將菌株264ZY7鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。通過室內(nèi)盆栽防效試驗，結(jié)果表明該菌株對番茄細菌性葉斑病的防效達69%，此外，該菌株對8種病原真菌具有抑菌能力，說明抑菌譜較寬，且抑菌率均大于30%，對番瓜根腐病菌(Fusarium sp.)效果最明顯，抑菌率為52.84%。該研究結(jié)果為高寒草地紫花針茅內(nèi)生細菌264ZY47的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番茄葉斑病菌；拮抗內(nèi)生細菌；篩選；鑒定；防效

DOI：10.11686/cyxb2014450http://cyxb.lzu.edu.cn

馮中紅， 王玉琴， 楊成德， 薛莉， 陳秀蓉. 番茄細菌性葉斑病菌的拮抗菌篩選、鑒定及其拮抗性能評價. 草業(yè)學報, 2015, 24(8): 166-173.

Feng Z H, Wang Y Q, Yang C D, Xue L, Chen X R. Screening， identification and assessment of endophytic bacteria antagonistic totomato bacterial spot. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 166-173.

收稿日期：2014-11-03；改回日期：2014-12-10

基金項目：甘肅省蔬菜攻關(guān)項目(No.GJ201307) 資助。

作者簡介：馮中紅(1991-),女,甘肅臨夏人,在讀碩士。E-mail:1142595813@qq.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

Screening， identification and assessment of endophytic bacteria antagonistic totomato bacterial spot

FENG Zhong-Hong, WANG Yu-Qin, YANG Cheng-De*, XUE Li, CHEN Xiu-Rong

CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemGansuAgriculturalUniversity,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

Abstract:After screening by assessing inhibition zones on nutrient media an antagonistic endophytic bacteria, strain 264ZY7, was identified as having strong antagonistic ability against Pseudomonas syringe pv. tomato which causes bacterial spot on tomatoes. This strain was selected from 120 endophytic bacteria strains isolated from alpine meadow pasture. Strain 264ZY7 produced a 1.22 cm diameter inhibition zone. The bacteria is rod-shaped with a spore size of 1.534 μm×0.571 μm-3.210 μm×0.781 μm, gram-positive and was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on morphology and homology analysis of the 16S rDNA and gyrB gene sequence. The control efficacy of strain 264ZY7 on bacterial spot on tomatoes grown in pots ranged up to 69%. It was also able to control fungal pathogens, in particular Fusarium sp. (52.84% efficacy). These results suggest that further development and utilization of this endophytic bacteria strain (264ZY7) should be undertaken.

Key words:Pseudomonas syringe; antagonistic endophytic bacteria; screening; identification; control effect

番茄細菌性葉斑病(番茄細菌性斑點病)(Pseudomonassyringapv.tomato)主要發(fā)生在番茄(Lycopersiconesculentum)、辣椒(Capsicumannuum)和茄子(Solanummelongena)等植物，其自1933年首次報道以來，在美國、英國、前蘇聯(lián)、加拿大、法國、南非和澳大利亞等26個國家和中國的臺灣省都有發(fā)生[1]。Yunis和Crall[2]報道，該病可造成番茄5%~75%的產(chǎn)量損失，Bonn 和 Martin[3]報道了美國部分州番茄受害情況，番茄細菌性葉斑病我國最初只在臺灣有記載[2]，后趙廷昌等[4]報道在吉林省、遼寧省、黑龍江省、河北省、甘肅省、新疆維吾爾自治區(qū)和天津市也有發(fā)生。近年來，該病迅速蔓延，在高溫高濕條件下易流行，一般發(fā)病率在40%以上，嚴重時可達100%[5]，且嚴重度呈增長趨勢。目前，番茄細菌性葉斑病主要利用化學農(nóng)藥防治，盡管有一定效果，但化學防治會引起植物病原抗藥性和農(nóng)藥殘留等問題，造成環(huán)境污染和生態(tài)破壞[6]，而生物防治既可取得良好的防治效果，又能克服以上缺點，已成為目前研究熱點。植物病害生防菌主要從土壤或植物根際土壤微生物中分離篩選得到[7]。研究發(fā)現(xiàn)，所有健康植物體內(nèi)幾乎都存在內(nèi)生細菌[8]，且部分內(nèi)生細菌具有良好的抑菌功能，其開發(fā)為微生物農(nóng)藥后具有可能在植物體內(nèi)長期定殖，環(huán)境影響小和持效期長等優(yōu)點。因此，從植物內(nèi)生細菌中篩選拮抗細菌進行生物防治被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ籟9]。本研究通過從東祁連山高寒草地牧草的根、莖、葉、花等部位分離的內(nèi)生細菌中篩選了一株對番茄細菌性葉斑病菌具有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌，對其拮抗能力和室內(nèi)盆栽防治效果等進行了研究，并進行了鑒定，以期為進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試菌株

供試病原細菌：番茄細菌性葉斑病菌。

供試拮抗菌：采用常規(guī)分離法，分離自東祁連山高寒草地紫花針茅(Stipacapillata)、線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)和矮生嵩草(Kobresiahumilis)健康根、莖、葉、花部位的120株內(nèi)生細菌。

供試病原真菌：馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番瓜根腐病菌(Fusariumsp.)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)。

以上均由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院植物病理學實驗室提供。

1.2　培養(yǎng)基

參考文獻肉汁胨培養(yǎng)基(NA)、PDA培養(yǎng)基，方法見[10-11]。

1.3　拮抗菌的篩選

采用含菌平板抑菌圈測定法[12]，在100 mL熔解后冷卻至45℃左右的NA培養(yǎng)基中加入1 mL病原菌菌液(含菌量cfu/108mL)，混勻后制成含菌平板，然后在每個平板上分別均勻的接種120株拮抗菌株，3次重復，28℃恒溫培養(yǎng)，48 h后測量其抑菌透明圈大小并記錄數(shù)據(jù)。

1.4　拮抗菌株的鑒定

1.4.1形態(tài)觀察將篩選得到的拮抗菌株接種于NA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，觀察菌落的形態(tài)特征并描述；將活化12 h后的拮抗菌株進行革蘭氏染色[8]，觀察菌體著色和測量菌體大小(30個)，并拍照。

1.4.2分子生物學鑒定1) 16S rDNA序列鑒定。拮抗菌株DNA采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取。16S rDNA的擴增利用通用引物27F和1492R[13]。PCR擴增條件為95℃預變性5 min，94℃變性1 min，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；再在72℃下延伸8 min后終止反應。擴增反應體系總體積為50 μL，其中10×buffer 5 μL，MgCl2(25 mol/L)3 μL，dNTP(5 mmol/L)1 μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.5 μL，27F(10 μmol/L)1 μL，1492R(10 μmol/L)1 μL，Target DNA 1 μL，ddH2O 47.5 μL。經(jīng)凝膠電泳檢測后有特異性條帶的擴增產(chǎn)物送生工生物(上海)有限公司進行測序。將測定的序列與在GenBank中已知的序列進行Blast同源性比對分析，并用CLUSTALX 1.8進行多重序列比較，最后用Mega 4.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確該拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育學地位。

2) gyrB基因序列鑒定。由于細菌16S rDNA具有高度保守性[14]，在比較一些相似性比較高的近緣種時，gyrB基因更能準確的鑒定到種。拮抗菌株DNA的提取方法同1.4。以細菌gyrB基因擴增引物UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGGAAAGTTCGA-3′)和引物UP-2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGCGTCAGTCAT-3′)進行擴增[15]。擴增體系為10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mol/L)2 μL，dNTP(5 mmol/L)1 μL，Taq酶(5 U/μL)1 μL，UP-1 1 μL，UP-2 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O：15.5 μL，總體系為25 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后在72℃延伸10 min。

1.5　抑菌譜測定

采用平板對峙法[13]測定抑菌效果。將直徑5 mm供試病原真菌，包括馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌、小麥根腐病菌、孜然根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番瓜根腐病菌、番茄灰霉病菌和馬鈴薯褐腐病菌菌餅置于PDA 平板中央，與其四周2.5 cm處點接拮抗菌株264ZY7，每處理重復3次，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照指示菌滿皿后測量菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照的菌落直徑-處理的菌落直徑)/對照的菌落直徑×100

1.6　室內(nèi)盆栽防效測定

將拮抗菌和番茄細菌性葉斑病菌(病原菌)分別經(jīng)搖瓶液體培養(yǎng)24 h后，先將病原菌通過傷口接種法接種于健康的番茄植株葉片上，24 h后再接種拮抗菌懸液，保濕24 h后在室內(nèi)條件下待其發(fā)病，10 d后觀察發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)及拮抗菌對番茄葉斑病的相對防治效果。葉斑病病情指數(shù)分級標準為，0級：葉片無病斑；1級：0<病斑面積占總?cè)~片面積≤10%；2級：10%<病斑面積占總?cè)~片面積≤25%；3級：25%<病斑面積占總?cè)~片面積≤50%；4級：50%<病斑面積占總?cè)~片面積≤75%；5級：75%<病斑面積占總?cè)~片面積≤100%。計算方法[5]如下：

發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高代表值)×100%

防病效果=(病原菌對照的病情指數(shù)-拮抗菌處理的病情指數(shù))/病原菌對照的病情指數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1　拮抗菌篩選

從120株供試內(nèi)生細菌中篩選出14株對番茄細菌性葉斑病菌有明顯抑菌帶或抑菌圈的拮抗細菌，其抑菌圈直徑介于0.75~1.22 cm，抑菌帶寬介于0.20~0.65 cm，其中菌株264ZY7對病原菌的拮抗效果強且穩(wěn)定，抑菌帶寬達到0.65 cm(圖1)，說明該菌株具有開發(fā)為防治番茄細菌性葉斑病的生物農(nóng)藥的潛力。

圖1　264ZY7對番茄細菌性葉斑病的拮抗作用Fig.1　Antagonistic function of Pseudomonas syringae from strain 264ZY7

2.2　拮抗菌株264ZY7的鑒定

2.2.1形態(tài)學鑒定在NA平板培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3 d后，264ZY7菌落呈圓形，邊緣鋸齒狀，表面光滑，有光澤，中央有突起，米白色，不透明，菌落大小約為2 mm(圖2)。菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陽性，大小為1.534 μm×0.571 μm~3.210 μm×0.781 μm(圖3)。

圖2　264ZY7的菌落形態(tài) Fig.2　The colony of strain 264ZY7

圖3　264ZY7革蘭氏染色Fig.3　Strain 264ZY7 Gram

2.2.2分子生物學鑒定1) 16S rDNA序列鑒定。經(jīng)測序得到菌株264ZY7的16S rDNA基因有1460個堿基，其基因序列在GenBank中與已知序列進行Blast同源性比對，結(jié)果表明，264ZY7(KF831372)與已報道的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)(HQ840645)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)(HQ662594)，死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)(JF496473)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(JN382471)相似性均達99%，經(jīng)建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，拮抗菌株264ZY7與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)(HQ840645)同源性較近，初步將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖4　菌株264ZY7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　16S rDNA phylogenetic tree of strain 264ZY7

2) gyrB基因序列鑒定。經(jīng)測序得到菌株264ZY7的gyrB基因有595個堿基，其基因序列在GenBank中與已知序列進行Blast同源性比對，結(jié)果表明，264ZY7(KF831372)與已報道的解淀粉芽孢桿菌(HQ840645)相似性達99%，經(jīng)建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)可看出拮抗菌株264ZY7與解淀粉芽孢桿菌(AB829604)聚在一起，再結(jié)合形態(tài)學特征和16SrDNA序列分析結(jié)果，將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖5　菌株264ZY7的gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　gyrB phylogenetic tree of strain 264ZY7

2.3　抑菌譜測定

菌株264ZY7對番瓜根腐病菌、馬鈴薯枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌的抑菌效果較明顯，抑制率分別為52.84%，49.60%，44.97%，對番茄灰霉病菌、孜然根腐病菌、馬鈴薯炭疽病菌和小麥根腐病菌抑菌率均在30%以上，對馬鈴薯褐腐病菌也有一定的拮抗作用(表1，圖6)。

病原菌Pathogens對照CK(cm)菌株Strain264ZY7菌落直徑Diameterofcolony(cm)抑制率Inhibitionrate(%)馬鈴薯枯萎病菌F.avenaceum6.22±0.103.13±0.0749.60孜然根腐病菌F.solani8.53±0.025.23±0.0438.67小麥根腐病菌B.sorokiniana7.68±0.185.12±0.0433.41馬鈴薯褐腐病菌S.stemonitis6.93±0.196.33±0.048.65馬鈴薯炭疽病菌C.coccodes5.63±0.123.48±0.0638.17黃瓜枯萎病菌F.oxysporum5.97±0.113.28±0.0744.97番茄灰霉病菌B.cinerea6.57±0.153.98±0.1039.34番瓜根腐病菌Fusariumsp.5.87±0.102.77±0.0552.84

數(shù)值后“±”表示標準誤。Data followed by “±” indicate mean error.

圖6　264ZY7與8種病原真菌的對峙照片F(xiàn)ig.6　264ZY7 confront eight kinds of pathogenic fungi photos　1:馬鈴薯枯萎病菌F. avenaceum; 2:孜然根腐病菌F. solani; 3:小麥根腐病菌B. sorokiniana; 4:馬鈴薯褐腐病菌S. stemonitis; 5:馬鈴薯炭疽病菌C. coccodes; 6:黃瓜枯萎病菌F. oxysporum; 7:番茄灰霉病菌B. cinerea; 8:番瓜根腐病菌Fusarium sp.

2.4　室內(nèi)盆栽防效測定

經(jīng)盆栽試驗，拮抗菌株264ZY7接種10 d后，對照的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為94.38%，55.06%，拮抗菌處理后的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為54.67%，17.07%，拮抗菌株264ZY7對番茄細菌性葉斑病的防效達69%，說明此拮抗菌對番茄葉斑病有較好的防治效果。

3結(jié)論與討論

應用拮抗微生物防治細菌性病害在國內(nèi)外已有大量報道，如何紅等[16]從健康的辣椒植株體內(nèi)分離篩選出多株對炭疽病、枯萎病等具有較強拮抗和防病作用的內(nèi)生細菌；黎起秦等[17]從番茄中分離到對番茄青枯病具有防病效果的內(nèi)生芽孢桿菌B47(抑菌圈直徑0.3 cm)；黃明媛等[18]從番茄根系土壤中分離篩選出4株對番茄青枯病抑菌活性較強的拮抗菌株(抑菌圈0.097~0.330 cm)；李偉杰和姜瑞波[19]也分離篩選出一株對番茄青枯病拮抗作用較強的內(nèi)生細菌X10(抑菌圈0.104 cm)。內(nèi)生細菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件的影響，可以在植物體內(nèi)獨立的分裂繁殖和傳遞，篩選有益的內(nèi)生細菌成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用[20]，本研究從東祁連山高寒草地牧草內(nèi)分離篩選的內(nèi)生細菌264ZY7對番茄細菌性葉斑病的抑菌圈直徑達到1.22 cm，抑菌帶寬度0.65 cm，比黎起秦等[17]、黃明媛等[18]、李偉杰和姜瑞波[19]報道的抑菌能力更強。

國內(nèi)報道了大量有關(guān)解淀粉芽孢桿菌防治植物病害的研究，且多為防治植物病原真菌病害，如張靜等[21]報道了解淀粉芽孢桿菌對山茶灰斑病菌有較好的拮抗作用；陳士云等[22]研究了一株防治油菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)形成的解淀粉芽孢桿菌；權(quán)春善等[23]報道了從堆肥中分離到一株對植物病原菌尖鐮刀菌(Fusariumoxysporum)有強烈抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌Q12；趙輝等[24]報道了從芝麻連作田里分離到一株解淀粉芽孢桿菌，對菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)和芝麻長蠕孢(Helminthosporiumsesami)有抑菌活性；趙曉燕等[25]報道了一株對煙草青枯病菌有一定拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌。本研究對菌株264ZY7經(jīng)形態(tài)觀察，并結(jié)合分子生物學16S rDNA和gyrB基因序列相似性分析，鑒定其為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens，此外，該菌株對本實驗室內(nèi)保存的番瓜根腐病菌(抑菌率：52.84%)、馬鈴薯枯萎病菌(抑菌率：49.60%)和黃瓜枯萎病菌(抑菌率：44.97%)等病原真菌均有良好的拮抗作用，這與以上報道的解淀粉芽孢桿菌對多種植物病原真菌有較好的拮抗作用結(jié)果一致，本試驗中該菌株對細菌性病菌有較好拮抗作用的結(jié)果與趙曉燕等[25]報道的結(jié)果相符，且解淀粉芽孢桿菌防治番茄細菌性葉斑病菌在國內(nèi)首次報道，但其詳細的抑菌機制還有待于進一步探索研究。

趙健等[12]對番茄青枯病的內(nèi)生拮抗細菌進行室內(nèi)盆栽防效的測定，結(jié)果表明菌株ZB-6對番茄青枯病的防病效果可達63%～65%，范曉靜等[26]在室內(nèi)盆栽條件下，得出內(nèi)生細菌Fq7對番茄細菌性葉斑病的防病效果達62.71%，本試驗中菌株264ZY7對番茄細菌性葉斑病的盆栽防效達到69%，說明該菌株對番茄細菌性葉斑病菌有較好的抑制作用，在微生物農(nóng)藥的開發(fā)利用中潛力巨大。但是該生防菌株的作用機理、發(fā)酵條件等尚不明確，還需進一步研究。

References：

[1]Zhao T C, Yu L, Sun F Z,etal. Tomato bacterial speck disease and its prevention. Plant Protection, 1999, 25(4): 56.

[2]Yunis G P, Crall J M. First report of a bacreial speck of tomato byPseudomonassyringapv.tomatoin Georgia. Plant Disease, 1980, 83: 199.

[3]Bonn, Martin H L. Bacterial spot of tomato leaves occurrence law in Frolidia. Journal of Experimental Agriculture, 1980, 39: 479-485.

[4]Zhao T C, Sun F Z, Song W S. Pathogen identification of bacterial speck of tomato. Acta Phytopathologica Sinica, 2001, 31(1): 37-42.

[5]Deng G, Qu X, Chen X R,etal. Pathogen identification of bacterial leaf speck of tomato based on 16S rDNA, physiology and biochemistry in Gansu. Plant Protection, 2008, 34(5): 47-51.

[6]Yi Y J, Luo K, Liu E M. Effect of endophytic bacterial on biological control of plant disease. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2007, 21(5): 474-477.

[7]Li C S. A review on research progress of the biologicial control of soil-borne plant diseases with bacteria. Chinese Journal of Biological Control, 1992, 8(4): 168-172.

[8]Luo M Y, Lu X J, Liao X L. Research advances on application of endophytic bacteria. Modern Agricultural Science and Technology, 2010, (7): 11-12.

[9]Huang X, Xu L L, Huang R S,etal. Research advance in controlling plant diseases byBacillussubtilis. Biotechnology Bulletin, 2010, (1): 24-28.

[10]Fang Z D. Research Method of Plant Pathology (Third Edition)[M]. Beijing: Chinese Agriculture Press, 1998: 110, 182-183.

[11]Gao X X, Man B Y, Chen X R,etal. Identification and determination of biological characteristics ofKobresiacapillifoliaendophytic bacteria X4 in the East Qilian Mountain Alpine grasslands. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(4): 137-146.

[12]Zhao J, Lan C Z, Chen Q H,etal. Isolation of endophytic bacteria from tomato and selection of antagonistic bacteria to tomato bacterial wilt disease. Wuyi Science Journal, 2006, 22(1): 49-54.

[13]Li Z D, Chen X R, Yang C D. Identification ofPolygonumviviparumendophytic bacteria Z17 and its capacity to antagonistic towards pathogenic fungi. Pratacultural Science, 2011, 28(12): 2096-2101.

[14]Wang L, Lee F, Tai C,etal. Comparison of gyrB gene sequences,16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in theBacillussubtilisgroup. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1846-1850.

[15]Yamamoto S, Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis ofPseudomonasputida strains. Applied Environmental Microbiology, 1995, 61: 1104-1109.

[16]He H, Cai X Q, Hong Y C,etal. Selection of endophytic antifungal bacteria from capsicum. Chinese Journal of Biological Control, 2002, 18(4): 171-175.

[17]Li Q Q, Luo K, Lin W,etal. Isolation of tomato endophytic antagonists againstRalstoniasolanacearum. Acta Phytopathologica Sinica, 2003, 33(4): 364-367.

[18]Huang M Y, Gu W J, Zhang F B,etal. Identification and fermentation of antagonistic bacterium againstRalstoniasolanacearum. Microbiology, 2011, 38(2): 214-220.

[19]Li W J, Jiang R B. Isolation of tomato antagonists againstRalstoniasolanacearum. Journal of Microbiology, 2007, 27(1): 5-8.

[20]Yang M L, Sun X L. Research of endophytic bacteria. Microbiology, 1998, 25(4): 224-227.

[21]Zhang J, Ran X X, Zhu T H,etal.Bacillusamyloliquefaciensantimicrobial effect onPestalotiopsisguepini(Desm.) Stey. Journal of Northeast Forestry University, 2014, (7): 122-125.

[22]Chen S Y, Yang B Y, Gao M Y,etal. Inhibition of sclerotia formation of sclerotinia sclerotiorum byBacillusamyloliquefaciens. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2005, 11(3): 373-376.

[23]Quan C S, Wang J H, Xu H T,etal. Identification and characterization of aBacillusamyloliquefacienswith high antifungal activity. Acta Microbiologica Sinica, 2006, 46(1): 7-12.

[24]Zhao H, Lu C T, Liu H Y,etal. Identification of aBacillusamyloliquefaciensstrain and preliminary research on its antifungal activity. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2014, 43(4): 75-79.

[25]Zhao X Y, Yang H, Chen J G,etal. Screening and fermentation optimization of antagonistic bacillus against tobacco bacterial wilt. Hubei Agricultural Sciences, 2014, (8): 1810-1814.

[26]Fan X J, Yang C Q, Qiu S X,etal. Identification of biocontrol bacterial strain and its antagonistic activity to tomato bacterial speck and colonizing ability in tomato. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2013, 42(4): 337-341.

[1]趙廷昌, 于莉, 孫福在, 等. 番茄細菌性斑點病及其防治. 植物保護, 1999, 25(4): 56.

[4]趙廷昌, 孫福在, 宋文生. 番茄細菌性斑點病病原菌鑒定. 植物病理學報, 2001, 31(1): 37-42.

[5]鄧剛, 屈星, 陳秀蓉, 等. 甘肅番茄細菌性斑點病病原菌鑒定. 植物保護, 2008, 34(5): 47-51.

[6]易有金, 羅寬, 劉二明. 內(nèi)生細菌在植物病害生物防治中的作用. 核農(nóng)學報, 2007, 21(5): 474-477.

[7]李長松. 拮抗性細菌生物防治植物土傳病害的研究進展. 生物防治通報, 1992, 8(4): 168-172.

[8]羅茗月, 路雪君, 廖曉蘭. 植物內(nèi)生細菌的應用研究進展. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010, (7): 11-12.

[9]黃曦, 許蘭蘭, 黃榮韶,等. 枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展. 生物技術(shù)通報, 2010, (1): 24-28.

[10]方中達. 植病研究方法(第三版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 110, 182-183.

[11]高曉星, 滿百膺, 陳秀蓉, 等. 東祁連山線葉嵩草內(nèi)生細菌X4的產(chǎn)吲哚乙酸、解磷、抗菌和耐鹽特性研究及分子鑒定. 草業(yè)學報, 2013, 22(4): 137-146.

[12]趙健, 蘭成忠, 陳慶河, 等. 抗番茄青枯病內(nèi)生拮抗細菌的篩選及室內(nèi)防效測定. 武夷科學, 2006, 22(1): 49-54.

[13]李振東, 陳秀蓉, 楊成德. 珠芽蓼內(nèi)生菌Z17抑菌能力測定及其鑒定. 草業(yè)科學, 2011, 28(12): 2096-2101.

[16]何紅, 蔡學清, 洪永聰, 等. 辣椒內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌的篩選. 中國生物防治, 2002, 18(4): 171-175.

[17]黎起秦, 羅寬, 林緯, 等. 番茄青枯病內(nèi)生拮抗細菌的篩選. 植物病理學報, 2003, 33(4): 364-367.

[18]黃明媛, 顧文杰, 張發(fā)寶, 等. 番茄青枯病拮抗菌篩選鑒定及其發(fā)酵條件初探. 微生物學通報, 2011, 38(2): 214-220.

[19]李偉杰, 姜瑞波. 番茄青枯病拮抗菌的篩選. 微生物學雜志, 2007, 27(1): 5-8.

[20]楊梅蓮, 孫曉璐. 植物內(nèi)生細菌的研究. 微生物學通報, 1998, 25(4): 224-227.

[21]張靜, 冉曉瀟, 朱天輝, 等. 解淀粉芽孢桿菌對山茶灰斑病菌的抑制作用. 東北林業(yè)大學學報, 2014, (7): 122-125.

[22]陳士云, 楊寶玉, 高梅影, 等. 一株抑制油菜核盤菌菌核形成的解淀粉芽孢桿菌. 應用與環(huán)境生物學報, 2005, 11(3): 373-376.

[23]權(quán)春善, 王軍華, 徐洪濤, 等. 一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究. 微生物學報, 2006, 46(1): 7-12.

[24]趙輝, 魯傳濤, 劉紅彥, 等. 一株生防芽孢桿菌的鑒定及其抑菌活性的初步研究. 河南農(nóng)業(yè)科學, 2014, 43(4): 75-79.

[25]趙曉燕, 楊歡, 陳建剛, 等. 一株煙草青枯病生防菌的篩選鑒定及其發(fā)酵優(yōu)化. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2014, (8): 1810-1814.

[26]范曉靜, 楊春泉, 邱思鑫, 等.番茄細菌性斑點病生防菌的鑒定、防病及定殖力. 福建農(nóng)林大學學報(自然科學版), 2013, 42(4): 337-341.