2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的重復性和診斷閾值分析

孟存仁，　唐　婧，　張朝霞

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，新疆 烏魯木齊 830054)

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2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的重復性和診斷閾值分析

孟存仁，唐婧，張朝霞

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，新疆 烏魯木齊 830054)

摘要：目的分析2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗丙型肝炎病毒(HCV)抗體的重復性和陽性預測值≥95%時的信號/臨界值(S/CO)比值。方法分別用Addcare ELISA 1100全自動酶免疫分析系統(tǒng)(簡稱Addcare系統(tǒng))和TECAN+FAME組合系統(tǒng)，以間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗HCV抗體，重組免疫印跡分析(RIBA)確認抗HCV抗體。收集高、中、低3個水平的樣本，在一批檢測內重復檢測20次(孔)，計算分析內精密度；在10 d以上時間內單次(孔或管)重復進行20批檢測，計算分析間精密度。收集202份血清，以RIBA確證試驗結果為金標準，用受試者工作特征(ROC)曲線分別確定2個檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)，并分別確定2個檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的陽性預測值≥95%時的S/CO比值的范圍。結果Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的分析內變異系數(shù)(CV)分別為5%、8%、10%和3%、7%、8%，分析間CV分別為8%、12%、15%和6%、10%、13%。2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)分別為3.20和2.90。2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的陽性預測值≥95%時的S/CO比值范圍分別為≥2.41和≥2.57。結論國產Addcare 系統(tǒng)和進口TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測的結果重復性好，符合率高。酶免疫分析系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV抗體具有各自最佳的S/CO比值，且S/CO比值與確證試驗陽性有一定的相關性，可用S/CO比值預測抗HCV抗體陽性。研究確定酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體最佳診斷閾值和陽性預測值≥95%時的S/CO比值有助于提高檢測結果的可靠性，減少須進行確證試驗的樣本數(shù)。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的丙型肝炎呈全球分布，世界人口的3%即大約1.7億人為HCV感染者，且發(fā)展中國家高于發(fā)達國家[1]?？笻CV抗體的檢測是目前應用最廣泛的用于流行病學調查和臨床HCV感染的檢測項目，為丙型肝炎的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供可靠的依據(jù)[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )是抗HCV抗體篩查最常用的方法，但在HCV低感染率人群中，ELISA檢測抗HCV抗體的假陽性問題仍較突出，因此美國疾病預防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention, CDC)曾于1998年建議：對抗HCV抗體篩查陽性者應進一步用重組免疫印跡分析(recombinant immunoblot analysis，RIBA)或核酸檢測(nucletide acid test，NAT)檢驗后方可報告[3]。然而這2種確證試驗成本及技術要求高，目前在實際工作中尚難以推廣。鑒于此，2003年美國CDC建議：可根據(jù)ELISA篩查的信號/臨界值(signal-to-cut off, S/CO)比值來確定其是否需要作NAT和RIBA，并認為用S/CO比值判斷真陽性，既可提高檢測報告的可靠性，又可減少進一步用NAT和RIBA檢測的樣本數(shù)，從而大大節(jié)省檢測費用[4]。目前國內尚缺乏抗HCV抗體的診斷標準及指南，由于國產試劑與進口試劑存在較大差異[5]，國外的標準可能并不適用于國產試劑。因此，本研究擬采用2種自動化酶聯(lián)免疫分析儀即國產Addcare ELISA 1100全自動酶免疫分析系統(tǒng)(簡稱Addcare系統(tǒng))和進口TECAN+FAME組合系統(tǒng)分別與同一國產試劑組成的檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的重復性、符合率、最佳診斷閾值和陽性預測值≥95%時的S/CO比值范圍。

材料和方法

一、研究對象

收集2013年3至7月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心血清樣本202份，分離血清，置-80 ℃保存待測。樣本來源對象男93例，女109例，年齡1～82歲，其中來自肝病科門診和住院部(臨床診斷疑似丙型肝炎患者)132份，來自普通門診和體檢中心(健康人)70份。

二、儀器和試劑

1. 檢測儀器(1)Addcare系統(tǒng)(煙臺生物科技有限公司)；(2)TECAN加樣系統(tǒng)(瑞士帝肯公司)和FAME后處理系統(tǒng)(瑞士哈美頓公司)組合。(1)和(2)分別與下列“2. 抗HCV抗體檢測試劑”之(1)組成檢測系統(tǒng)。

2. 抗HCV抗體檢測試劑(1) 間接ELISA檢測抗HCV抗體試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，批號C20130406)陽性判斷限 S/CO比值≥1；(2)RIBA抗HCV抗體確證試驗試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，批號RC20130101)；(3)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心提供的質控血清(濃度為1 NCU/mL，批號201206001)。所有試劑均在有效期內使用，按說明書操作。

三、方法

1. 重復性試驗(1)分析內精密度的驗證：高、中、低3個水平的樣本，在一批檢測內重復檢測20次(孔)，計算所得吸光度(A)值的均值和標準差，計算分析內變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。(2)分析間精密度的驗證：高、中、低3個水平的樣本，在10 d以上時間內單次(孔或管)重復進行20批檢測，計算所得A值的均值和標準差，計算分析間CV。

2. 最佳診斷閾值(S/CO比值)的確定收集202份血清，用Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體，同時用RIBA確認抗HCV抗體，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分別確定2個酶免疫檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體在本實驗室的最佳診斷閾值(S/CO比值)。以RIBA確證試驗結 果為金標準，分別確定2個檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的陽性預測值≥95%時的S/CO比值范圍。

四、統(tǒng)計學方法

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)錄入和整理，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。用配對四格表χ2檢驗比較2個酶免疫分析系統(tǒng)以原陽性判斷限所得的檢測結果的差異。以RIBA確證試驗結果為金標準，繪制ROC曲線，計算曲線下面積，并探討其最佳臨界值即約登指數(shù)最大時的S/CO比值，據(jù)此確定抗HCV抗體最佳診斷閾值(S/CO比值)。用配對四格表χ2檢驗比較ROC曲線確定的2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳閾值下的檢測結果的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、重復性試驗

1.分析內精密度的驗證Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體高、中、低3個水平的樣本，分析內CV分別為5%、8%和10%。TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測3個水平的樣本，分析內CV分別為3%、7%和8%。

2.分析間精密度的驗證Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體高、中、低3個水平的樣本，在10 d時間重復進行20批檢測，分析間CV分別為8%、12%和15%。TECAN+FAME組合系統(tǒng)相應的分析間CV分別為6%、10%和13%。

二、 Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)與RIBA確證試驗檢測抗HCV抗體結果比較

1. 2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的原陽性判斷限下的結果比較按試劑盒規(guī)定的原陽性判斷限，Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體陽性162例，TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體陽性163例，二者檢測抗HCV抗體的符合率為97.5%。見表1。

表1　2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的原陽性判斷限下的檢測結果

注：P=1.000

2. RIBA檢測RIBA確證陽性142份，陰性60份。142份陽性樣本的條帶和強度特點見表2。

3. Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)與RIBA確證試驗檢測抗HCV抗體結果比較以RIBA確證試驗結果為金標準，按試劑盒提供的閾值(S/CO比值=1)，Addcare系統(tǒng)的假陽性率為33%，TECAN+FAME組合系統(tǒng)的假陽性率為35%。見表3。

表2　142份RIBA陽性樣本5個抗原區(qū)條帶強度

表3　Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)分別與RIBA確證試驗檢測抗HCV抗體結果比較

三、ROC曲線確定2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的檢測性能

以RIBA檢測結果為金標準，繪制2個酶免疫分析系統(tǒng)的抗HCV抗體ROC曲線，分析顯示， Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)為3.20，此時的敏感性和特異性分別為99.3%和96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC曲線下面積為0.998；TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)為2.90，此時的敏感性和特異性分別99.3%和96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC曲線下面積為0.998，見圖1、圖2。ROC曲線確定的2個不同酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)下的檢測結果符合率為100%，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)。見表4。

圖1　Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的ROC曲線圖

圖2　TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的

Addcare系統(tǒng)(S/CO比值=3.20)TECAN+FAME組合系統(tǒng)(S/CO比值=2.90)+-合計+1420142-06060合計14260202

四、2個酶免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體陽性預測值≥95%的S/CO比值范圍

以RIBA確證試驗結果為金標準，Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的S/CO比值≥2.41時，陽性預測值≥95%；TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的S/CO比值≥2.57時，陽性預測值≥95%。見表5、表6。

表5　Addcare系統(tǒng)不同S/CO比值時的陽性預測值

注：*為陽性預測值≥95%時的S/CO比值截點

表6　TECAN+FAME組合系統(tǒng)不同

注： *為陽性預測值≥95%時的S/CO比值截點

討論

HCV的感染呈世界性分布，全球HCV感染率約為3%，約1.7億人感染HCV，每年新增病例(300~400)萬。各個國家、地區(qū)和不同人群之間存在較大差異，美國、荷蘭一般人口HCV感染率為0.2%~1.8%，埃及一般人群HCV感染率可達10%~30%[6-7]。我國一般人群抗HCV抗體陽性率為3.2%，抗HCV抗體陽性率隨年齡緩慢上升，男女間無明顯差異[8]。

隨著醫(yī)學科技的不斷發(fā)展，血液樣本的免疫檢測已經(jīng)趨向于自動化、程序化，目前許多實驗室都同時使用2種及2種以上不同廠家的全自動酶免疫儀器進行血液樣本的ELISA檢測。由于檢測系統(tǒng)的不同，結果是否具有可比性關系到血液樣本的檢測質量[9]。Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)的相同之處在于使ELISA從加樣到出結果的試驗過程標準化、規(guī)范化，避免了手工操作的誤差，提高了檢測的精確度和特異性，重復性好，同時大大降低了操作人員的勞動強度，提高了工作效率，且能減少操作失誤，避免交叉污染，也提高了操作人員的自身安全性，特別適合醫(yī)院大批量樣本的檢驗，能滿足臨床及大量體檢的需求。該2個系統(tǒng)最大的不同之處在于Addcare系統(tǒng)是加樣、后處理一體機，有2個工作艙(前、后艙自動轉板，避免污染)，3臺獨立洗板機(前、后艙均可使用，每臺洗板機均為96針洗板頭，洗板強度大、效果好)，開放操作(易受環(huán)境溫度干擾)；TECAN+FAME組合系統(tǒng)是TECAN加樣系統(tǒng)和FAME后處理系統(tǒng)組合的酶免疫分析系統(tǒng)，人為轉板，易污染，2臺洗板機(每臺洗板機均為24針洗板頭，洗板效果較差)，后處理機內部操作(受環(huán)境溫度干擾小)。本研究探討現(xiàn)階段臨床實驗室普遍采用的Addcare和TECAN+FAME組合系統(tǒng)使用同一國產試劑檢測抗HCV抗體各自的重復性、2個系統(tǒng)間的符合率、最佳閾值和陽性預測值≥95%時的S/CO比值范圍。

本研究結果顯示，Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測高、中、低水平抗HCV抗體的分析內和分析間CV均符合國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心規(guī)定的ELISA分析內(≤10%)和分析間(≤15%)的范圍要求。但若按試劑盒規(guī)定的原陽性判斷限，Addcare系統(tǒng)與TECAN+FAME組合系統(tǒng)間檢測抗HCV抗體結果的符合率僅為97.5%。

在HCV低感染率人群中，ELISA檢測抗HCV抗體的假陽性問題仍較突出，據(jù)此1998年美國CDC建議，抗HCV抗體篩查陽性結果需要采用RIBA或NAT證實后方可報告陽性[3]。然而，由于RIBA或NAT對設備和技術的要求相對較高，費時、費力且費用較高，我國采供血機構和臨床實驗室均未對抗HCV抗體篩查陽性樣本進行常規(guī)RIBA或NAT確證試驗[10-11]。2003年，美國CDC根據(jù)Abbot EIA 2.0和Ortho version 3.0抗HCV抗體 ELISA對不同感染率人群的篩查結果，建議將S/CO比值≥3.8作為HCV感染陽性報告的參考閾值，即當這2種抗HCV抗體 ELISA篩查試驗的S/CO比值≥3.8時，其陽性預測值≥95%，可不進行確證試驗，直接報告陽性結果[12]。

為探討國產ELISA試劑和自動化免疫分析系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值，本研究以RIBA檢測結果為參照，經(jīng)對2個酶免疫分析系統(tǒng)不同診斷閾值(S/CO比值)繪制的ROC曲線分析處理，Addcare系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)為3.20(敏感性和特異性分別為99.3%和96.7%)，TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)為2.90(敏感性和特異性分別為99.3%和96.7%)，按Addcare系統(tǒng)和TECAN+FAME組合系統(tǒng)的上述最佳診斷閾值，2個系統(tǒng)間檢測抗HCV抗體結果的符合率達100%。抗HCV抗體診斷試劑盒ELISA說明書提供的診斷閾值(S/CO比值)為1，與本研究所確定的診斷閾值相差較大，若按照說明書上提供的診斷閾值判斷檢測結果，會導致較高的假陽性率(Addcare系統(tǒng)的假陽性率為33%，TECAN+FAME組合系統(tǒng)的假陽性率為35%)。由于ELISA方法學上的缺陷，抗HCV抗體檢測出現(xiàn)假陽性的原因有：(1)高球蛋白血癥[13]；(2)類風濕因子的干擾，如血清或血漿樣本中存在類風濕因子，則其可與固相上的IgG和酶標記的IgG結合，從而出現(xiàn)假陽性反應；(3)樣本中超氧化物歧化酶的干擾；(4)用于固相包被的HCV基因工程抗原不純[14]；(5)試劑的保存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)影響[15]。本研究所確定的最佳診斷閾值高于試劑盒提供的S/CO比值(≥1)，雖然TECAN+FAME組合系統(tǒng)的敏感性略有降低，但2個系統(tǒng)的特異性和陽性預測值均相應提高。

本研究以RIBA確證試驗結果為金標準，國產Addcare系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV抗體的S/CO比值≥2.41時陽性預測值≥95%，進口TECAN+FAME組合系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV抗體的S/CO比值≥2.57時陽性預測值≥95%。本研究所得2個檢測系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的陽性預測值≥95%時的S/CO比值的范圍低于美國CDC建議的Abbot EIA 2.0和Ortho version 3.0的S/CO比值3.8，其中可能有檢測系統(tǒng)和不同實驗室間的操作差異，也可能與檢測人群HCV的感染率有關，由此突顯針對不同檢測系統(tǒng)、不同實驗室和不同感染率人群確定不同的陽性預測值≥95%的S/CO比值的必要性。我們呼吁國內不同地域的實驗室開展對國內常用抗HCV抗體試劑的多中心研究，以獲得國內的相應S/CO比值。在本實驗室條件下，用上述2個系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的S/CO比值分別≥2.41和≥2.57可直接報告陽性結果，但對于S/CO比值在1.00~2.41和1.00~2.57之間的樣本需要進行2種檢測系統(tǒng)之間互相復查之后進一步考慮做確證試驗。

本研究以RIBA結果為金標準，ROC曲線分析結果顯示，2個酶免疫分析系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV抗體的最佳診斷閾值(S/CO比值)分別為3.20和2.90。2個酶免疫分析系統(tǒng)ELISA檢測抗HCV抗體的陽性預測值≥95%時的S/CO比值的范圍分別為≥2.41和≥2.57。兩者的差異在于：前者是兼顧敏感性和特異性的最佳診斷閾值，關注檢測系統(tǒng)的綜合檢測性能；后者則重點關注提高陽性預測值，降低假陽性率。實驗室可依據(jù)檢測目的決定選項。

在獻血者血液篩選和臨床診斷2種情況下，抗HCV抗體檢測的目的有所不同。前者較強調注重假陰性，對于可疑樣本一般認定為不合格；而后者需結合流行病學及臨床資料，務求臨床診斷準確無誤，便于治療。在臨床診斷方面，抗HCV抗體檢測可存在滴度波動變化和假陽性問題，所以一次抗體的檢測對于診斷只能作為參考，而在治療方面仍需綜合多指標(如RIBA和NAT結果)作為實施治療和判斷預后的主要參考依據(jù)[16]。

在具一定規(guī)模的醫(yī)療機構中，2個或2個以上檢測系統(tǒng)同時檢測同一項目的現(xiàn)象非常普遍，如何評價定性試驗檢測性能，保證結果的一致性，是實驗室質量保證的內容之一[17]。本研究探討的國產Addcare系統(tǒng)和進口TECAN+FAME組合系統(tǒng)檢測抗HCV抗體的重復性俱佳；在以RIBA檢測結果為金標準、用ROC曲線確定各自最佳診斷閾值后，診斷性能明顯改善，檢測結果符合率明顯提高，因此可以同時應用于抗HCV抗體的檢測。本研究提供了ELISA檢測抗HCV抗體篩查試驗的復查標準，由于ELISA檢測抗HCV抗體S/CO比值與確證試驗陽性有一定的相關性，即S/CO比值可以預測抗HCV抗體真陽性，以本研究確定的陽性預測值≥95%時的S/CO比值作為是否須進行確證試驗的標準，可減少須進行確證試驗的樣本數(shù)，從而達到在提高檢測結果可靠性的同時減少人力、財力支出的目的。

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(本文編輯：姜敏)

關鍵詞：抗丙型肝炎病毒抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗；重復性；診斷閾值

Analysis on repeatability and diagnostic threshold value of 2 ELISA systems for anti-HCV antibody determinationMENGCunren，TANGJing，ZHANGZhaoxia.(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，XinjiangUrumqi830054，China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the repeatability and signal-to-cut off (S/CO) ratio of positive predictive value ≥95% in the determination of anti-hepatitis C virus (HCV) antibody by 2 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems. MethodsRecombinant immunoblot analysis (RIBA) was used to confirm anti-HCV antibody. Using Addcare ELISA 1100 automatic system (Addcare system) and TECAN+FAME combined system， by indirect ELISA, anti-HCV antibody was determined. High, medium and low concentrations of samples were collected. In 1 run of determination， the determination was repeated for 20 times(holes), and the precision of intra-analysis was calculated. For more than 10 d in a single (hole or pipe), 20 runs of determinations were performed， and inter-analysis precision was calculated .A total of 202 serum samples were collected, and receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the optimal diagnostic threshold value[signal-to-cut off (S/CO) ratio]of 2 ELISA systems for the determination of anti-HCV antibody. The S/CO ratio scope of positive predictive value ≥95% of anti-HCV antibody determination of 2 ELISA systems was identified. ResultsThe intra-analysis coefficients of variation (CV) were 5%， 8% and 10% for Addcare system and 3%， 7% and 8% for TECAN + FAME combined system， while the inter-analysis CV were 8%， 12%， 15% and 6%， 10%， 13%， respectively. The optimal diagnostic threshold values (S/CO ratios) of 2 ELISA systems were 3.20 and 2.90. The S/CO ratio scopes of positive predictive value ≥95% of anti-HCV antibody determination of 2 ELISA systems were≥2.41 and≥2.57. ConclusionsThe Addcare system and TECAN +FAME combined system have excellent repeatability and coincidence rate. The anti-HCV antibody determined by 2 ELISA systems has optimal S/CO ratio, and the S/CO ratio is correlated with confirmation assay positivity， so S/CO ratio can be used to predict anti-HCV antibody positivity. The optimal diagnostic threshold value and the S/CO ratio of positive predictive value≥95% are helpful for improving the results′ reliability and reducing the sample numbers of confirmation assay.

Key words:Anti-hepatitis C virus antibody;Enzyme-linked immunosorbent assay; Repeatability; Diagnostic threshold value

收稿日期：(2014-10-21)

通訊作者：張朝霞，聯(lián)系電話：0991-4361446。

作者簡介：孟存仁，男，1972年生，碩士，副主任技師，主要從事分子生物學檢驗工作。

基金項目：衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心專項課題(28-1-13)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1175-06R446.61

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.003