用CODEHOP法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆草魚(yú)多聚免疫球蛋白受體基因片段

許國(guó)晶，王超，孟慶磊，劉峰，劉飛，陳秀麗

(山東省淡水漁業(yè)研究院 山東省鹽堿地漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250013)

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用CODEHOP法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆草魚(yú)多聚免疫球蛋白受體基因片段

許國(guó)晶，王超，孟慶磊，劉峰，劉飛，陳秀麗

(山東省淡水漁業(yè)研究院 山東省鹽堿地漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250013)

摘要:為克隆草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus多聚免疫球蛋白受體pIgR基因，本研究中借助于NCBI、Blast等數(shù)據(jù)庫(kù)及Primer Premier 5.0、DNAMAN等生物軟件，利用CODEHOP法設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，并對(duì)克隆基因進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果表明：用CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物特異性強(qiáng)，試驗(yàn)成功率高；草魚(yú)pIgR基因?qū)儆谡麄€(gè)脊椎動(dòng)物的pIgR基因群，與鯉Cyprinus carpio同源性最高,為84%。

關(guān)鍵詞:草魚(yú)；CODEHOP；多聚免疫球蛋白受體 (pIgR)

黏膜免疫系統(tǒng)作為第一道抵抗外界病毒和細(xì)菌入侵的特異性免疫防御屏障，在免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)過(guò)程中起著極其重要的作用[1-3]。多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor，pIgR)是由黏膜上皮細(xì)胞合成，是重要的免疫因子，能夠與分泌型免疫球蛋白(Ig)多聚體結(jié)合，介導(dǎo)其跨過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，進(jìn)而保證分泌型免疫球蛋白在黏膜防御屏障中發(fā)揮局部清除病原體及毒素的作用，因此，pIgR的有效分泌是保證分泌型免疫球蛋白發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件[4-7]。目前，pIgR基因已在人類、哺乳動(dòng)物(牛、鼠等)、鳥(niǎo)類和兩棲類中克隆較多[5,8-9]。在硬骨魚(yú)中僅有幾種魚(yú)類得到克隆，包括對(duì)紅鰭東方鲀Takifugurubripes、斑馬魚(yú)Daniorerio、大西洋鮭Salmosalar、鯉Cyprinuscarpio、牙鲆Paralichthysolivaceus、斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides、大菱鲆Scophthalmusmaximus和虹鱒Oncorhynchusmykiss[10-16]等pIgR基因全長(zhǎng)cDNA 序列的克隆，對(duì)其他魚(yú)類未見(jiàn)有關(guān)于pIgR基因克隆的報(bào)道。本研究中，首次克隆了草魚(yú)CtenopharyngodonidelluspIgR基因，為探索其在魚(yú)類黏膜免疫中的功能及深入研究pIgR的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供理論支撐。

用傳統(tǒng)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)出的引物簡(jiǎn)并度一般會(huì)比較高，同時(shí)因引物長(zhǎng)度一般小于25個(gè)，導(dǎo)致引物退火溫度(Tm)值會(huì)偏低，進(jìn)而造成假陽(yáng)性較多，不利于RT-PCR擴(kuò)增[17]。采用CODEHOP法設(shè)計(jì)引物可降低引物簡(jiǎn)并度，提高引物Tm值，從而增強(qiáng)反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于應(yīng)用CODEHOP法克隆水產(chǎn)動(dòng)物基因僅在對(duì)半滑舌鰨CynoglossussemilaevisCYP17 基因的克隆中報(bào)道過(guò)[18]，本研究中采用CODEHOP(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)在線軟件設(shè)計(jì)草魚(yú)pIgR基因片段的簡(jiǎn)并引物，并利用生物軟件Primer Premier 5.0及DNAMAN對(duì)CODEHOP設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行分析，克隆草魚(yú)pIgR基因，該方法較傳統(tǒng)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的方法有較大改進(jìn)[17,19]，所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物能更好地與模板進(jìn)行匹配，從而更加有利于RT-PCR試驗(yàn)的成功，也為今后克隆水產(chǎn)動(dòng)物基因提供了新的技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)魚(yú)草魚(yú)取自山東省淡水漁業(yè)研究院，平均體長(zhǎng)為36 cm，平均體質(zhì)量為531 g，保存于液氮中。

1.1.2主要數(shù)據(jù)庫(kù)和生物軟件NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、CODEHOP(http://blocks. fhcrc.org/codehop.html)、Block Maker(http://blocks.fhcrc.org/blockmkr/make_blocks. html)、Primer Premier 5.0、Mega 5.2、DNAMAN。

1.1.3菌體與質(zhì)粒克隆菌體采用大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒采用pMD18-T Vector，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.4試劑Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，Gengreen購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司，LATaq酶、DNA Marker、克隆載體試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)首先在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并從中找出3個(gè)與草魚(yú)親緣關(guān)系較近的魚(yú)類pIgR氨基酸序列，分別為鯉Cyprinuscarpio(GenBank 登錄號(hào)：ADB97624) 、斑馬魚(yú)Daniorerio(GenBank 登錄號(hào)：ABQ10652) 、大西洋鮭 (GenBank 登錄號(hào)：ACX44838)，將上述3種魚(yú)類的pIgR氨基酸序列保存為FASTA格式，并提交至BlockMaker 網(wǎng)站，得到保守區(qū)后，從BlockMaker Results網(wǎng)頁(yè)直接登錄CODEHOP 數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物的主要參數(shù)：Degeneracy為128，Temperature為60.0 ℃，Genetic code為standard，Codon usage table為Daniorerio。引物密碼表中沒(méi)有草魚(yú)選項(xiàng)，所以選擇進(jìn)化地位較近的模式生物D.rerio。

1.2.2簡(jiǎn)并引物的篩選首先根據(jù)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)的普遍原則和引物退火溫度值，篩選出分值較高的引物，盡量選擇分?jǐn)?shù)大于75分的引物。然后根據(jù)簡(jiǎn)并引物在氨基酸序列保守區(qū)內(nèi)的位置，篩選出簡(jiǎn)并度較低的引物。再在3種魚(yú)中選出其中一種魚(yú)(與要克隆的物種親緣關(guān)系盡量相近)，采用DNAMAN查看篩選出的簡(jiǎn)并引物在其mRNA模板中的位置，并分析簡(jiǎn)并引物與模板mRNA的匹配程度，選取匹配程度較高的引物。最后再利用Primer Premier 5.0進(jìn)行簡(jiǎn)并引物自身的檢測(cè)：(1)分析兩條上、下游簡(jiǎn)并引物自身是否存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(2)兩條上、下游簡(jiǎn)并引物之間是否存在二聚體；(3)兩條上、下游簡(jiǎn)并引物的Tm值不要相差太大，盡量不要超過(guò)5 ℃。

1.2.3簡(jiǎn)并擴(kuò)增草魚(yú)pIgR基因選取草魚(yú)肝組織進(jìn)行總RNA提取。RNA提取步驟按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，操作過(guò)程中注意防止RNA酶污染。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，再用已經(jīng)篩選好用CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物及用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的同樣保守區(qū)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

篩選出的用CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物：

上游引物5′ CTCAGTACATCTCCTACGTGaartaytggtg 3′；

下游引物5′ TCCGGATCGGCACcanykyttytc 3′。

篩選出的用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物：

上游引物5′ CGCARTACRYCAGYHAYGTGAA-GTACTGGTG 3′；

下游引物5′ HCCACTRCGACACCAMYGCTTCT-C 3′。

PCR 反應(yīng)體系(共25 μL)： 10×Taqbuffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，cDNA模板 0.5 μL、上、下游引物各1 μL，TaqDNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。采用降落PCR的反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s， 64~55 ℃下退火30 s(每一循環(huán)降1 ℃，之后為55 ℃)，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于4 ℃下保存。

1.2.4PCR 產(chǎn)物分析反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物在含Gengreen的瓊脂糖凝膠(10 g/L)上進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)含有目的片段后利用Omega瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收的特異性目的片段采用克隆載體試劑盒連接入pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，在氨芐青霉素平板上涂布，挑取平板上的單菌落，以載體通用引物(Primer RV-M和Primer M13-47)進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)正確后，搖菌并測(cè)序。

1.2.5序列分析將生工生物工程(上海)有限公司的測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI Blast進(jìn)行序列比對(duì)，分析草魚(yú)pIgR基因序列與其他物種的同源性。

1.2.6系統(tǒng)進(jìn)化分析將不同物種的pIgR氨基酸序列通過(guò)ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)后，用Mega 4.0軟件的鄰位相接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物

采用BlockMaker對(duì)鯉、斑馬魚(yú)、大西洋鮭的pIgR氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)分析比對(duì)后，共得到7個(gè)非常保守的氨基酸區(qū)域。再采用CODEHOP設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，經(jīng)過(guò)DNAMAN、Primer Premier 5.0分析，最終篩選出如表1所示的1對(duì)引物。

表1　上下游簡(jiǎn)并引物

注：大寫(xiě)字母表示5′端的非簡(jiǎn)并夾板區(qū)，小寫(xiě)字母表示3′端的核心簡(jiǎn)并區(qū)

Note:Capital letters represent 5′non- degenerate consensus clamp,and letters represente 3′ degenerate core

2.2簡(jiǎn)并PCR電泳結(jié)果

以草魚(yú)肝臟RNA為模板(圖1)，用CODEHOP設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖2-A所示,在455 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，與推斷的結(jié)果基本一致，并且沒(méi)有出現(xiàn)非特異性條帶。而用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖2-B所示,在400～500 bp處出現(xiàn)多條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性不強(qiáng)。因此,在后續(xù)進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析及測(cè)序時(shí)均采用CODEHOP設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物及其進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。

圖1　草魚(yú)肝組織總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1　Agarose electrophoresis of total RNA in hepatopancreas of grass carp Ctenopharyngodon idellus

注：A為CODEHOP法；B為傳統(tǒng)方法Note:A,CODEHOP;B,the traditional method圖2　草魚(yú)肝組織RT-PCR電泳圖譜Fig.2　Electrophoresis of RT-PCR in hepatopancreas of grass carp Ctenopharyngodon idellus

2.3測(cè)序結(jié)果及序列分析

測(cè)序結(jié)果如圖3所示,將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI BlastX進(jìn)行同源性比較,結(jié)果如表2所示。從表2可見(jiàn)：克隆的草魚(yú)pIgR氨基酸序列與鯉的同源性最高(84%)，其次為斑馬魚(yú)(75%)，與虹鱒、大西洋鮭、斜帶石斑魚(yú)、大菱鲆、紅鰭東方鲀、牙鲆、大西洋鱈pIgR氨基酸序列的同源性為50%~59%。由此可見(jiàn)，草魚(yú)pIgR基因片段屬于整個(gè)脊椎動(dòng)物的pIgR基因群。經(jīng)Sequin提交，得到草魚(yú)pIgR基因序列的GenBank登錄號(hào)為KP238177，該片段編碼151個(gè)氨基酸。

圖3　草魚(yú)pIgR基因片段Fig.3　Fragment of pIgR gene from grass carp Ctenopharyngodon idellus

物種species GenBank登錄號(hào)accessionNo.分值maxscore期望值Evalue同源性identity/%鯉CyprinuscarpioADB97624.12451e-7784斑馬魚(yú)DaniorerioABQ10652.12384e-7675虹鱒OncorhynchusmykissADB81776.11811e-5258大西洋鮭SalmosalarACX44838.11812e-5258斜帶石斑魚(yú)EpinepheluscoioidesACV91878.11774e-5159大菱鲆ScophthalmusmaximusAGN54539.11768e-5159牙鲆ParalichthysolivaceusADK91435.11608e-4555紅鰭東方鲀TakifugurubripesNP_001266944.11571e-4353大西洋鱈GadusmorhuaAIR74929.11403e-3750

2.4系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)構(gòu)建18種動(dòng)物的pIgR 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，研究草魚(yú)pIgR在進(jìn)化上的保守性。其中9種動(dòng)物pIgR氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表2，除魚(yú)草外其余8種動(dòng)物及pIgR 氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)分別為人Homosapiens(CAA51532.1)、褐家鼠Rattusnorvegicus(EDM09843.1)、牛Bostaurus(AAC41620.1)、小家鼠Musmusculus(AAA67440.1)、馬Equuscaballus(ACX69975.1)、雞Gallusgallus(AAP69598.1)、非洲爪蛙Xenopuslaevis(ABK62772.1)和眼鏡王蛇Ophiophagushannah(ETE63349.1)。從圖4可見(jiàn)：該進(jìn)化樹(shù)主要分成3部分，第一部分是哺乳類(包括人、牛、馬、小家鼠、褐家鼠)，第二部分是鳥(niǎo)類(雞)、爬行類(眼鏡王蛇)和兩棲類(非洲爪蛙)，第三部分是硬骨魚(yú)類；在硬骨魚(yú)類中，草魚(yú)pIgR氨基酸序列與鯉最接近，其次與斑馬魚(yú)較近。

圖4　根據(jù)不同物種pIgR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4　Phylogenetic tree constructed for the amino acid sequences of pIgR in different species

3討論

用CODEHOP設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物與用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物不同，分為3′端的核心簡(jiǎn)并區(qū)和5′端的非簡(jiǎn)并夾板區(qū)兩部分。3′端核心簡(jiǎn)并區(qū)由小寫(xiě)字母表示，是由9~12個(gè)編碼高度保守的氨基酸堿基序列組成，在RT-PCR擴(kuò)增中與最相近的cDNA進(jìn)行匹配；5′端是非簡(jiǎn)并夾板區(qū)，其長(zhǎng)度略長(zhǎng)，用大寫(xiě)字母表示。因CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物的非簡(jiǎn)并夾板區(qū)最大程度地反推了保守氨基酸的堿基序列，使后續(xù)RT-PCR擴(kuò)增具有較強(qiáng)的特異性，也使得CODEHOP方法優(yōu)于特異性較差的傳統(tǒng)簡(jiǎn)并PCR方法。傳統(tǒng)方法通常不適用于擴(kuò)增物種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或序列拷貝數(shù)較低的情況，而CODEHOP法則適用[18,20]。在用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，會(huì)檢索出大量的引物序列，因此，需要進(jìn)行仔細(xì)篩選。本研究中，先利用CODEHOP設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)并引物，再用DNAMAN對(duì)上下游引物與其中1種魚(yú)模板mRNA進(jìn)行比對(duì)，查看其匹配程度，再用Primer Premier 5.0對(duì)簡(jiǎn)并引物自身進(jìn)行分析(發(fā)夾結(jié)構(gòu)、Tm值、二聚體)，從而為后續(xù)試驗(yàn)的成功奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物特異性強(qiáng)，沒(méi)有雜帶，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

在脊椎動(dòng)物黏膜免疫中，多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌需要一系列免疫分子和免疫細(xì)胞的協(xié)同作用。其中多聚免疫球蛋白受體pIgR就是起重要作用的免疫分子，它可以很好地與分泌型多聚免疫球蛋白結(jié)合，從而介導(dǎo)其向黏膜擴(kuò)散。在哺乳動(dòng)物中，pIgR含有5個(gè)類似Ig結(jié)構(gòu)功能區(qū)(Ig-like domain,ILD1~ILD5)，鳥(niǎo)類(雞)和兩棲類(非洲爪蟾)pIgR含有4個(gè)Ig樣功能區(qū)[6,9]，而魚(yú)類pIgR被證明僅含有2個(gè)Ig樣功能區(qū)，分別和哺乳動(dòng)物的ILD1和ILD5相對(duì)應(yīng)[10-16]。對(duì)紅鰭東方鲀和牙鲆的研究結(jié)果表明，魚(yú)類pIgR中2個(gè)ILDs能很好地結(jié)合分泌型Ig[10,16]，說(shuō)明魚(yú)類pIgR轉(zhuǎn)運(yùn)分泌型四聚體IgM需要ILDs功能區(qū)少，而轉(zhuǎn)運(yùn)哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類或兩棲類中分泌型IgA二聚體或IgA三聚體，則需要4~5個(gè)ILDs功能區(qū)。Norderhaug等[21]研究表明，如果pIgR敲除Ig樣功能區(qū)2和Ig樣功能區(qū)3，則不能與分泌型IgA多聚體結(jié)合。推測(cè)原因，可能是因?yàn)镮gA二聚體或IgA三聚體中間的亞基距離較遠(yuǎn)，而IgM四聚體則縮小了亞基之間的空間距離，因此，需要pIgR的ILDs功能區(qū)也較少。但真正的結(jié)合模式還需要進(jìn)行深入地研究[22]。本研究中成功地克隆了草魚(yú)pIgR基因，經(jīng)分析得出，草魚(yú)pIgR基因?qū)儆谡麄€(gè)脊椎動(dòng)物的pIgR基因群，尤其是硬骨魚(yú)類亞群。

本研究為后續(xù)研究pIgR在健康草魚(yú)不同組織中的差異表達(dá)情況及免疫應(yīng)答特征、蛋白結(jié)構(gòu)特征奠定了基礎(chǔ)，不僅豐富了魚(yú)類黏膜免疫方面的基本理論，用于更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，更為深入地研究草魚(yú)pIgR在黏膜免疫球蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用機(jī)制提供了理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]Santos N M S D,Taveme-Thiele J J,Bames A C,et al.The gill is a major organ for antibody secreting cell production following direct immersion of sea bass (DicentrarchuslabraxL.) in aPhotobacteriumdamselaessp.piscicida bacterin:an ontogenetic study[J].Fish and Shellfish Immunology,2001,11(1):65-74.

[2]Xu D H,Klesius P H,Shelby R A.Cutaneous antibodies in excised skin from channel catfish,IctaluruspunctatusRafinesque,immune toIchthyophthiriusmultifiliis[J].Journal of Fish Diseases,2002,25(1):45-52.

[3]Cain K D,Jones D,Raison R L.Characterization of mucosal and systemic immune response in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) using surface plasmon resonance[J].Fish and Shellfish Immunology,2000,10(8):651-666.

[4]Gurevich P,Zusman I,Moldavsky M,et al.Secretory immune system in human intrauterine development:immunopathomorphological analysis of the role of secretory component (pIgR/SC) in immunoglobulin transport (review)[J].International Journal of Molecular Medicine,2003,12(3):289-297.

[5]Kaetzel C S.The polymeric immunoglobulin receptor:bridging innate and adaptive immune responses at mucosal surfaces[J].Immunological Reviews,2005,206:83-99.

[6]Braathen R,Hohman V S,Brandzaeg P,et al.Secretory antibody formation:conserved binding interactions between J chain and polymeric Ig receptor from humans and amphibians[J].Journal of Immunology,2007,178(3):1589-1597.

[7]唐慶娟,戚欣,耿美玉.多聚免疫球蛋白受體(pIgR) 在黏膜免疫中的重要功能[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2007,23(9):724-729.

[8]Asano M,Saito M,Fujita H.Molecular maturation and functional expression of mouse polymeric immunoglobulin receptor[J].Journal of Immunological Methods,1998,214:131-139.

[9]Wieland W H,Orzaez D,Lammers A,et al.A functional polymeric immunoglobulin receptor in chicken (Gallusgallus) indicates ancient role of secretory IgA in mucosal immunity[J].Biochemical Journal,2004,380:669-676.

[10]Hamuro K,Suetake H,Saha N R,et al.A teleost polymeric Ig receptor exhibiting two Ig-like domains transports tetrameric IgM into the skin[J].Journal of Immunology,2007,178:5682-5686.

[11]Rombout J H W M,van der Tuin S J L,Yang G,et al.Expression of the polymeric Immunoglobulin Receptor (pIgR) in mucosal tissues of common carp (CyprinuscarpioL.)[J].Fish and Shellfish Immunology,2008,24:620-628.

[12]Feng L N,Lu D Q,Bei J X,et al.Molecular cloning and functional analysis of polymeric immunoglobulin receptor gene in orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides)[J].Comparative Biochemistry and Physiology B，2009,154:282-289.

[13]Zhang Y A,Salinas I,Li J,et al.IgT,a primitive immunoglobulin class specialized in mucosal immunity[J].Nature Immunology,2010,11:827-835.

[14]Tadiso T M,Sharma A,Hordvik I.Analysis of polymeric immunoglobulin receptor and CD300-like molecules from Atlantic salmon[J].Molecular Immunology,2011,49(3):462-473.

[15]Xu G J,Zhan W B,Ding B J,et al.Molecular cloning and expression analysis of polymeric immunoglobulin receptor inounder (Paralichthysolivaceus)[J].Fish and Shellfish Immunology,2013,35:653-660.

[16]丁冰潔,繩秀珍,唐小千.大菱鲆多聚免疫球蛋白受體基因的克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2013,20(4):792-801.

[17]黃菁,王少麗,喬傳令.程序化設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物與克隆小菜蛾酯酶基因[J].昆蟲(chóng)知識(shí),2002,39(6):458-461.

[18]陳彩芳,溫海深,何峰,等.程序化設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物克隆半滑舌鰨CYP17基因[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009,39(6):1213-1218.

[19]夏瑞,陸旺金,李建國(guó).簡(jiǎn)并引物的程序化設(shè)計(jì)與荔枝HMGR基因片段的克隆[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2006,23(6):903-906.

[20]李運(yùn)合,孫光明.利用CODEHOP和iCODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆芒果LAX基因家族片段[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2011,32(12):2278-2282.

[21]Norderhaug I N,Johansen F E,Krajci P,et al.Domain deletions in the human polymeric Ig receptor disclose differences between its dimeric IgA and pentameric IgM interaction[J].European Journal of Immunology,1999,29(10):3401-3409.

[22]王磊.鯉魚(yú)多聚免疫球蛋白受體(cpIgR)功能的研究[D].濟(jì)南:山東師范大學(xué),2009:27-29.

Cloning of polymeric immunoglobulin receptor gene fragment

in grass carpCtenopharyngodonidellususing degenerate

primers designed by CODEHOP

XU Guo-jing, WANG Chao, MENG Qing-lei, LIU Feng, LIU Fei，CHEN Xiu-li

(Saline-alkali Fishery Engineering Technology Research Center of Shandong Province, Freshwater Fisheries Research Institute of Shandong Province, Jinan 250013, China)

Abstract：The gene of polymeric immunoglobulin receptor(pIgR)of grass carp Ctenopharyngodon idellus was cloned by a pair of degenerate primers designed by CODEHOP, and by combined bioinformatics including NCBI, Blast and biological software such as Primer Premier 5.0 and DNAMAN, and the homology and phylogenetic tree of the clone of pIgR gene were analyzed in the PCR products. The results showed that degenerate primers designed by CODEHOP were characterized by specificity and benefit for the experiment accomplishing. pIgR gene of grass carp was found to clustered into pIgR gene group in all the other vertebrates, especially into the fish subgroup, with the maximal homology (84%) with common carp Cyprinus carpio.

Key words：Ctenopharyngodon idellus; CODEHOP; polymeric immunoglobulin receptor (pIgR)

作者簡(jiǎn)介：許國(guó)晶(1984—)， 女， 博士。E-mail:guojingxu18@sina.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31440090)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目；山東省財(cái)政支持農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目

收稿日期：2014-12-29

中圖分類號(hào)：S965.111;Q512.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1388(2015)02-0138-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.005