菲律賓蛤仔RP2基因的克隆及組織表達分析

裴愛君，楊艷津，秦艷杰，趙祥吉，閆喜武，李霞，王福景

(大連海洋大學(xué) 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023)

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菲律賓蛤仔RP2基因的克隆及組織表達分析

裴愛君，楊艷津，秦艷杰，趙祥吉，閆喜武，李霞，王福景

(大連海洋大學(xué) 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023)

摘要:采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)與cDNA末端快速克隆(RACE)法首次從殼長為28 mm的菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(GenBank登錄號:KF826881)。結(jié)果表明：RP2基因cDNA序列長度為1158 bp，包括62 bp的5′端非編碼區(qū)，41 bp的3′端非編碼區(qū)，開放閱讀框1053 bp，編碼350個氨基酸;推導(dǎo)的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守結(jié)構(gòu)域，并為非跨膜糖蛋白;經(jīng)Blast同源性比較表明，菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列與太平洋牡蠣Crassostrea gigas的相似性較高(56%)，與高等哺乳動物、鳥類、魚類、兩棲類和節(jié)肢動物各模式動物之間的相似性為43%~53%，與非洲眼線蟲Loa loa的相似性較低(33%);利用實時定量PCR技術(shù)檢測RP2基因在菲律賓蛤仔不同組織中的表達，結(jié)果顯示，RP2基因在菲律賓蛤仔雄性性腺中表達量最高，在鰓、水管和外套膜組織中次之，在斧足和閉殼肌中表達量極少，在雌性性腺中無表達。研究表明，RP2基因在菲律賓蛤仔各組織中的表達較為廣泛，但不同組織的表達量存在明顯差異，本研究結(jié)果可為無脊椎動物RP2基因的結(jié)構(gòu)及其功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞:菲律賓蛤仔；視網(wǎng)膜色素變性基因2；分子克?。?組織表達分析

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是一組具有顯著臨床及遺傳異質(zhì)性的遺傳性眼病。在各遺傳類型中，X染色體連鎖遺傳(X-linked retinitis pigmentosa, XLRP)臨床表現(xiàn)最為嚴重，且發(fā)病年齡早，人一般在10歲前即發(fā)病，40歲前即可完全失明[1]。目前，XLRP已經(jīng)定位7個基因位點，5個位于X染色體的短臂Xp(RP2、RP3、RP6、RP15、RP23)，2個位于X染色體的長臂Xq(RP24、RP34)。人Homosapiens的RP2基因(GenBank登錄號：NM_006915.2)于1998年被克隆，定位于Xp11.3，包含 5 個外顯子, 編碼含350 個氨基酸殘基的多肽鏈[2]。視網(wǎng)膜色素變性2(retinitis pigmentosa 2, RP2)，也稱為TBCCD2，是一個含350個氨基酸的蛋白，定位于細胞胞質(zhì)側(cè)，屬于TBCC家族。RP2蛋白具有促進微管蛋白GTP酶活性的功能，作為ADP核糖化類因子3(ARL3)的鳥苷酸解離抑制因子，可阻止GTP結(jié)合形式的ARL3解離。編碼RP2基因的缺陷，會引起視網(wǎng)膜色素變性, 以感光細胞退化為發(fā)病特點，導(dǎo)致夜間視力失明，最終使外周和中樞視覺喪失[3-4]。通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)，大約20%的XLRP是由于RP2基因突變所致[5]。目前，對人RP2基因突變引發(fā)疾病的相關(guān)報道較多，在低等動物中，葛廣韜等[6]研究了人RP2基因在果蠅Muscadomestica胚胎細胞中的表達，此項研究證明了人RP2基因在果蠅細胞中表達的可能性。斑馬魚DaniorerioRP2基因也已經(jīng)被成功地克隆[7]，并且研究表明，斑馬魚可以作為研究人類視網(wǎng)膜疾病的模式生物[8]。此外，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已有對太平洋牡蠣Crassostreagigas、紫球海膽Strongylocentrotuspurpuratus、玻璃海鞘Cionaintestinalis等多種海洋無脊椎動物RP2基因序列和預(yù)測蛋白的相關(guān)研究，但低等動物RP2基因的功能目前尚不清楚。

菲律賓蛤仔俗稱蛤仔、花蛤、蜆子，在貝類分類學(xué)上隸屬于軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、異齒亞綱Heterodonate、簾蛤目Veneroida、簾蛤科Veneridae，廣泛分布于中國沿海灘涂。菲律賓蛤仔是一種小型雙殼貝類，喜埋棲于內(nèi)灣風(fēng)浪較小、水流暢通并有淡水注入的中低潮區(qū)的泥沙灘涂中。本研究中，采用RT-PCR和SMARTRACE法，從菲律賓蛤仔外套膜中首次克隆得到了RP2基因的cDNA序列，并采用Real-time PCR技術(shù)分析了RP2基因在菲律賓蛤仔不同組織中的表達情況，旨在豐富低等動物RP2基因的研究內(nèi)容，并為該基因的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗用菲律賓蛤仔購自大連市黑石礁水產(chǎn)市場，2齡，殼長為28 mm左右，殼寬為20 mm左右。于2012年3月購回后在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)。

試驗用TRIZOL、PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒、SMARTTMRACE(Clontech)試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD?19-T Vector、感受態(tài)細胞大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、Sybr green I(20×)和DEPC水均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。試驗用引物及DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA合成取健康個體進行解剖，獲取外套膜后立即放入液氮中研磨，采用TRIZOL一步法進行Total RNA抽提，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，經(jīng)純化后將RNA于-80 ℃下保存。cDNA合成采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒，并按其說明書進行操作。

1.2.2RACE擴增基于遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心早期構(gòu)建的菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組cDNA測序結(jié)果，所得ESTs經(jīng)NCBI比對分析，發(fā)現(xiàn)一個EST 與RP2基因同源性較高。以此片段為目的片段，設(shè)計RACE擴增引物(表1)，采用SMARTTMRACE試劑盒進行基因克隆。具體操作按照說明書方法進行，其中試劑盒中已有的引物UPM/NUP見表1。RACE擴增體系(共25 μL)： 10×PCR Buffer 2.5 μL， MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2.0 μL，Clontech中的引物UPM/NUP(10 μmol/L) 2.5 μL，RP2-3′/RP2-3′EN或RP2-5′/RP2-5′EN引物1.0 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 12.75 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，51 ℃(3′RACE)/55 ℃(5′RACE)下退火30 s，72 ℃下延伸2 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體中，于16 ℃下連接過夜，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞 DH5α中，涂布于含有IPTG、Amp、X-Gal的平板上，于培養(yǎng)箱中(37 ℃)過夜后挑取白菌，加入到含有Amp的1 mL液體培養(yǎng)液中進行擴大培養(yǎng)。將菌液進行PCR檢測，引物為RV-M、M13-47(表1)。取檢測合格的菌液送到上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1　試驗用引物序列

1.2.3序列分析與進化樹的構(gòu)建將菲律賓蛤仔RP2基因cDNA序列用DNAstar軟件確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；利用Blast程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對；利用ProParam在線工具進行氨基酸理化性質(zhì)的分析；利用ProtScale在線工具分析氨基酸的親水疏水性；利用SOPMA在線工具對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用在線工具TMHMM Server 2.0和Signal P 4.1 Server分別對蛋白的跨膜區(qū)域和信號肽進行預(yù)測；利用在線工具Predict Protein對蛋白的功能位點進行預(yù)測；利用NCBI中的CD Search功能預(yù)測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用ClustalX 2.1軟件和Mega 5.1軟件采用鄰位相連法(Neighbor-joining, NJ)在Bootstrap置信值為1000的條件下構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4菲律賓蛤仔RP2基因組織特異性的表達分析隨機選取實驗室暫養(yǎng)的菲律賓蛤仔7只，分別取閉殼肌、斧足、水管、外套膜、鰓、雄性性腺和雌性性腺組織，按照“1.2.1”節(jié)中的方法進行RNA提取及cDNA合成。根據(jù)先期獲得的菲律賓蛤仔RP2基因cDNA序列，設(shè)計Real-time PCR 引物RP2-F和RP2-R，選取β-actin為內(nèi)參基因(表1)。

使用FTC2000(Canada)實時熒光定量PCR儀進行擴增，每個樣品重復(fù)擴增檢測3次。PCR擴增體系(共50 μL)：PCR buffer(2×)25 μL，RP2基因上、下引物(25 pmol/μL)各1 μL,Sybr green I(20×)0.5 μL,模板(cDNA)2 μL,DEPC水20.5 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性4 min；94 ℃下變性20 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行35次循環(huán)；最后在72 ℃下檢測信號。將Real-time PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出，繪制標準曲線，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達量，各組織間的表達量差異采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析和多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1菲律賓蛤仔RP2基因的序列分析

將測得的序列片段用DNAstar軟件進行拼接，最終得到菲律賓蛤仔RP2基因cDNA序列(圖1)。該cDNA序列長1158 bp，包括62 bp的5′端非編碼區(qū)，43 bp的3′端非編碼區(qū)，開放閱讀框1053 bp，編碼350個氨基酸。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

蛤仔RP2蛋白分子式為C1761H2716N454O542S25，原子總數(shù)為5498，相對分子質(zhì)量為39 711.1，理論等電點為4.76，在編碼的350個氨基酸中，含有48個帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)，33個帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)。總平均親水性(GRAVY)為-0.236，脂肪指數(shù)為77.63，不穩(wěn)定指數(shù)為40.01，因此,推算該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。預(yù)測結(jié)果顯示，菲律賓蛤仔RP2蛋白沒有信號肽，屬于非跨膜蛋白。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中有α螺旋89個(占25.43%)，延伸鏈87個(占24.86%)，β折疊11個(占3.14%)，無規(guī)卷曲163個(占46.57%)，其二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲組成。

通過在線預(yù)測工具Predict Protein分析蛋白位點發(fā)現(xiàn)：該序列含有1個N-糖基化位點；1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點；1個蛋白激酶C磷酸化位點；10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點；1個酪氨酸激酶磷酸化位點；3個N-豆蔻?；稽c。利用CD Search功能預(yù)測菲律賓蛤仔RP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，具有CARP(65aa~102aa)和TBCC(57aa~175aa)保守結(jié)構(gòu)域。

注：方框字母為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)；陰影處為TBCC結(jié)構(gòu)域；直線處為CARP結(jié)構(gòu)域Note:The start codon(ATG) and stop codon(TGA) are boxed;the TBCC domain is shaded; the CARP domain is lined圖1　菲律賓蛤仔RP2基因 cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1　cDNA and predicted amino acid sequences of RP2 gene in Manila clam Ruditapes philippinarum

2.2RP2氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析

將推導(dǎo)的菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列使用在線NCBI工具進行Blast同源性比較(表2)，結(jié)果表明，菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列與太平洋牡蠣的相似性為56%，與紅鰭東方鲀Takifugurubripes的相似性為53%，與褐家鼠Rattusnorvegicus的相似性為52%，與高等哺乳動物、鳥類、魚類、兩棲類和節(jié)肢動物各模式動物之間的相似性為49%~53%，但與紫球海膽Strongylocentrotuspurpuratus的相似性較低，為43%，與非洲眼線蟲Loaloa的相似性僅為33%。

表2RP2氨基酸序列的同源性比對

Tab.2Comparative identity of amino acid sequence of RP2

物種(GenBank登錄號)species(GenBankaccessionNo.)相似性/%identity太平洋牡蠣Crassostreagigas(EKC30628)56人Homosapiens(NP_008846)51倭黑猩猩Panpaniscus(XP_003809725)51非洲象Loxodontaafricana(XP_003418016)51野豬Susscrofa(XP_003360330)51犬Canislupusfamiliaris(XP_548972.251)51佛羅里達海牛Trichechusmanatuslatirostris (XP_004376963)51褐家鼠Rattusnorvegicus(NP_001102482)52雞Gallusgallus(NP_001008680)49非洲爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis(XP_002937023)51紅鰭東方鲀Takifugurubripes(XP_003973879)53青斑河豚Tetraodonnigroviridis(CAG01390)52斑馬魚Daniorerio(ADR82635)49紫球海膽Strongylocentrotuspurpuratus(XP_797121)43玻璃海鞘Cionaintestinalis(XP_002121234)50非洲眼線蟲Loaloa(EFO16689.2)33

菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫比較，經(jīng)Clustal W多重序列比對分析，結(jié)果顯示，菲律賓蛤仔RP2與太平洋牡蠣、褐家鼠、紅鰭東方鲀等RP2在CARP和TBCC結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列呈現(xiàn)較高的保守性。脊椎動物RP2氨基酸序列N末端具有非常保守的雙?；稽c(M-G-C-X-F-S-K)，而在菲律賓蛤仔、太平洋牡蠣、紫球海膽、玻璃海鞘和眼線蟲等無脊椎動物中，這些位點保守性較低。

應(yīng)用Mega 5.1 軟件在Bootstrap置信值為1000的條件下構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，該進化樹直觀地顯示了菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列與其他各物種之間的相互關(guān)系(圖2)。從圖2可見：菲律賓蛤仔與太平洋牡蠣先聚為一支；無脊椎動物中的紫球海膽、玻璃海鞘和非洲眼線蟲分別單獨聚為一支；硬骨魚類聚為一支，并分別逐級與爬行類、鳥類和哺乳動物聚在一起。

2.3RP2基因的組織表達分析

圖2　根據(jù)不同物種RP2氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2　Phylogenetic tree constructed for amino acid sequences of RP2 in different species

熒光實時定量PCR結(jié)果表明，RP2基因在菲律賓蛤仔閉殼肌、斧足、水管、外套膜、鰓、雄性性腺中均有表達，但在雌性性腺中無表達(圖3)。經(jīng)單因素方差分析表明，各組織中的表達量依次為雄性性腺>鰓>水管≈外套膜>斧足≈閉殼肌>雌性性腺?？梢姡琑P2基因在菲律賓蛤仔雄性性腺中表達量最高，與其他組織存在顯著性差異(P<0.05)，腮中的表達量與水管、外套膜也表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，但水管和外套膜之間的表達量相差不大(P>0.05)，閉殼肌和斧足表達量很少，而雌性性腺中無表達。

3討論

自RP2基因被首次克隆以來，迄今為止，已有獼猴Macacamulatta[9]、牛Bostaurus[10]、小家鼠Musmusculus[11]、褐家鼠[12]、雞[13]、非洲爪蟾[14]等RP2基因被克隆。本研究中獲得的菲律賓蛤仔RP2基因cDNA序列為1158 bp，編碼350個氨基酸。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列與其他物種RP2氨基酸序列有著較高的同源性(50%左右)。這些生物的RP2蛋白分子具有保守的CARP結(jié)構(gòu)域，并且N末端均存在與微管特異性分子伴侶輔助因子C(TBCC)同源序列。

注：標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level圖3　菲律賓蛤仔各組織中RP2基因的mRNA相對表達量Fig.3　Relative quantity of RP2 expressions in the different tissues of Manila clam Ruditapes philippinarum

TBCC通過與其他微管折疊輔助因子及GTP結(jié)合蛋白Arl2相互作用，參與微管蛋白生物的合成[15-16]。RP2蛋白能夠像輔助因子C一樣，與輔助因子D結(jié)合后促進微管蛋白GTP酶的活性，參與微管蛋白生物的合成。然而在脊椎動物中,RP2蛋白氨基酸序列C末端出現(xiàn)的類似核苷二磷酸激酶(NDks)保守結(jié)構(gòu)域，在低等動物如紫球海膽、玻璃海鞘和非洲眼線蟲RP2蛋白氨基酸序列中卻沒有出現(xiàn)，預(yù)測的菲律賓蛤仔RP2氨基酸序列也沒有出現(xiàn)該保守區(qū)。人類NDk1被證實具有3′至5′外切酶活性，研究也表明，人RP2可能具有DNA損傷響應(yīng)因子和3′至5′外切酶活性[17]。因此推測，低等動物RP2可能不具有這樣的功能。人的RP2蛋白氨基酸序列N末端的蛋氨酸M-甘氨酸G-半胱氨酸C-X-苯丙氨酸F-絲氨酸S-賴氨酸K-精氨酸序列具有雙酰基化位點，這對于蛋白膜定位是非常重要的，研究發(fā)現(xiàn)，該序列的第5位苯丙氨酸、第6位絲氨酸和第8位精氨酸突變會影響RP2蛋白，使其不能在質(zhì)膜上正確定位，從而引起X染色體連鎖遺傳[18-19]。本試驗中得到的PR2氨基酸序列中，第5位和第6位氨基酸均為亮氨酸L，而第8位為絲氨酸。因此，菲律賓蛤仔RP2氨基酸殘基的特異性可能使RP2基因在蛤仔中發(fā)揮著不同于脊椎動物的作用，該基因在無脊椎動物中的功能研究亟待開展。

菲律賓蛤仔不同組織中RP2基因的表達情況顯示，RP2基因在雄性性腺中表達量最高，比其他組織高出2個數(shù)量級。RP2基因在鰓、水管、外套膜中有相對較高的表達，在閉殼肌、斧足中表達量極低，在雌性性腺中無表達。有研究表明，雌性小鼠受到睪酮誘導(dǎo)后，腎臟中的RP2基因升高了10~12倍，這主要是由于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平升高造成的[20]。盡管RP2基因的表達受到雄性激素的誘導(dǎo)，但目前尚不清楚具體的原因。本研究中發(fā)現(xiàn)，蛤仔雄性性腺中RP2基因表達量最高，而雌性性腺中無表達，推測該基因可能受到雄性性腺發(fā)育過程中一些信號的誘導(dǎo)，但由于低等脊椎動物沒有類似于哺乳動物的雄性激素，其誘導(dǎo)原因有待進一步探討。貝類外套膜上具有外套眼的結(jié)構(gòu)，有研究表明，與脊椎動物比較起來，貝類的外套眼結(jié)構(gòu)較低等，只是接受光的刺激，傳導(dǎo)光沖動的線路[21]。但該基因在外套膜中的表達量并不是最高，反而極顯著低于雄性性腺，也顯著低于鰓組織。有研究表明，斑馬魚的RP2基因在早期發(fā)育階段就開始表達且可以延續(xù)至成體，基因敲除后發(fā)現(xiàn)，斑馬魚軀干彎曲，眼睛較小，且視網(wǎng)膜上出現(xiàn)了細胞死亡的現(xiàn)象。也有報道指出，RP2基因在高爾基體與纖毛間囊泡的運輸和融合過程中起重要作用[22-23]，因此，作者推測，RP2基因在蛤仔各組織中分布廣泛，可能參與囊泡運輸、微管形成等多項生物學(xué)活動。至于RP2基因在外套眼及其他組織器官發(fā)生發(fā)育過程中的功能還有待進一步探討。

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Cloning and expression ofRP2 gene in tissues of

Manila clamRuditapesphilippinarum

PEI Ai-jun, YANG Yan-jin, QIN Yan-jie, ZHAO Xiang-ji, YAN Xi-wu, LI Xia, WANG Fu-jing

(Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：In this study, Retinitis Pigmentosa 2 (RP2) gene was cloned from mantles of Manila clam Ruditapes philippinarum with shell length of 28 mm using reverse transcription PCR (PT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The results showed that the RP2 gene cDNA (GenBank accession No. KF826881) had length of 1158 bp, including a 62 bp 5′-untranslated region, a 41 bp 3′-untranslated region and a 1053 bp open reading frame, encoding a 350 amino acid protein. There were tubulin-specific chaperone protein cofactor (TBCC, 57aa-175 aa) homology domain and CARP(65aa-102 aa)conserved motif in the deduced amino acid sequence. Alignment of the RP2 protein sequence with orthologs from those of known species in NCBI showed that the RP2 protein sequence shared 56% of amino acid identity with sea urchin, 43%-53% with mammals, birds, fish, amphibians and Arthropoda. There was relatively low identity between Manila clam and nematode Loa loa (33%). Real-time PCR analysis of the expression profiling of RP2 gene in different tissues in the clam revealed that the maximal expression was observed in testis, followed in gill, siphon and mantle, the minimal in foot and adductor, and no expression in ovary, indicating that RP2 gene was expressed ubiquitously, without significant differences in different tissues. The findings provide basic information for understanding of the gene structure and function of RP2 gene in invertebrate and buried clams.

Key words：Ruditapes philippinarum; RP2 gene; molecular clone; tissue expression analysis

通信作者：秦艷杰(1977—)， 女， 博士， 副教授。E-mail: qinyanjie@dlou.edu.cn

作者簡介：裴愛君(1989—)， 女， 碩士 研究生。E-mail:peiaijun@yeah.net

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-48)

收稿日期：2014-06-09

中圖分類號：S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0132-06

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.004