超濾離心法測定銀杏內(nèi)酯B納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率

周　愷，姚　亮，戴浩志，林彤遠，朱婷婷，邢　蓉，陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥　230012；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠　233000)

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超濾離心法測定銀杏內(nèi)酯B納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率

周愷1，姚亮1，戴浩志1，林彤遠1，朱婷婷1，邢蓉2，陳衛(wèi)東1

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥230012；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠233000)

[摘要]目的建立超濾離心法測定銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carrier，NLC)包封率的方法，以便對GB-NLC處方進行優(yōu)化。方法利用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備GB-NLC，在電鏡下觀察其微觀形態(tài)，用納米激光粒度儀測定其粒徑和Zeta電位。建立超濾離心測定包封率方法，分離載藥NLC與游離GB，采用LC-MS/MS測定包載GB或游離GB含量，并計算包封率。結(jié)果制得GB-NLC外觀圓整，平均粒徑和電位分別為(173.10±5.84)nm和(-27.47±0.40)mV；超濾離心法測得包封率為(61.97±1.03)%。結(jié)論超濾離心法準確、快捷，適合作為GB-NLC包封率的測定方法。

[關(guān)鍵詞]銀杏內(nèi)酯B；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；包封率；超濾離心法

銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是從銀杏葉中提取的三萜內(nèi)酯類化合物，對心腦血管疾病具有顯著的藥理活性[1-2]，是極具應用前景的天然血小板活化因子受體拮抗劑[3]。然而GB在水中溶解度低、半衰期短等缺點限制了其臨床應用[4]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLC)是第二代脂質(zhì)納米粒，特點為采用液體脂質(zhì)以及固體脂質(zhì)作為混合脂質(zhì)核心包載藥物，可實現(xiàn)緩釋效果，延長藥物半衰期[5-7]。

評價NLC質(zhì)量的重要指標之一就是包封率。

[Abstract]ObjectiveTo study the effects of aqueous extract of Acorus tatarinowii on PC12 cell proliferation and processes and to evaluate whether the drug has a neurotrophic function or promotes cell differentiation. MethodsCell Counting Kit-8 was used to determine the effect of different concentrations of aqueous extract of Acorus tatarinowii on the viability of PC12 cells. The spindle cell rate, cell differentiation rate, length of cell processes, and the differentiation rate of positive cells were statistically analyzed using Image J software to evaluate the effect of aqueous extract of Acorus tatarinowii on PC12 cell proliferation. ResultsThe aqueous extract of Acorus tatarinowii significantly promoted PC12 cell proliferation in both complete culture environment and low-serum culture environment and significantly inhibited the growth, branching, and extension of cell processes. ConclusionThe aqueous extract of Acorus tatarinowii has a certain neurotropic function. Objective To develop a method for determination of the entrapment efficiency of ginkgolide B (GB)-loaded nanostructured lipid carriers (NLC) and to optimize GB-NLC-based prescriptions.MethodsGB-NLC was prepared by emulsion evaporation and low-temperature solidification. The micromorphology of GB-NLC was observed under a scanning electron microscope. Particle size and Zeta potential were also determined using a laser particle size analyzer. A centrifugal ultrafiltration technique was developed to isolate free GB from GB-NLC solution. The concentrations of free GB and entrapped GB were measured with liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and the entrapment efficiency was calculated. ResultsThe GB-NLC appeared spherical with a smooth surface. The average particle size and Zeta potential were (173.10±5.84)nm and (-27.47±0.40)mV, respectively. The mean entrapment efficiency determined by the centrifugal ultrafiltration technique was (61.97±1.03)%. ConclusionThe centrifugal ultrafiltration technique offers an accurate and fast method for determining the entrapment efficiency of GB-NLC.

[Key words]PC12; aqueous extract of Acorus tatarinowii; cell proliferation; cell processes常見的包封率測定方法包括超速離心法[8]、透析法[9]、微柱離心法[10]及超濾離心法[11]等。其中透析法耗時長，且需要大量透析介質(zhì)；超速離心法則對儀器有較高要求，高轉(zhuǎn)速下可能導致納米粒破裂；微柱離心法需要人工裝填凝膠填料，重現(xiàn)性較差，且受人為影響較大。因此，筆者建立了超濾離心法測定GB-NLC包封率的方法。 ginkgolide B; nanostructured lipid carrier; entrapment efficiency; centrifugal ultrafiltration

1儀器和試藥

1.1儀器Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；AB SCIEX 4500三重四級桿質(zhì)譜：上海愛博才思儀器貿(mào)易有限公司；SU8020掃描電鏡：日本日麗公司；3000HS型Zetasizer納米激光粒度儀：美國Malvern公司；AB-135型分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：密理博(上海)貿(mào)易有限公司；LC-4016低速離心機：中科中佳科學儀器有限公司；XW-80A渦旋混合儀：上海滬西儀器有限公司；DF-101S集熱式加熱攪拌器：江蘇省常州普天儀器制造有限公司；Amicon Ultra-4超濾離心管：密理博(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2試劑GB標準品(批號 110863-200806)：中國藥品生物制品檢定院；銀杏內(nèi)酯B原料藥：中國人民解放軍總醫(yī)院；格列苯脲(glibenclamide，GLY)標準品(批號 100135-200404)：中國藥品生物制品檢定院；單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、中鏈甘油三酯、卵磷脂、吐溫80：國藥集團化學試劑有限公司；色譜甲醇：德國默克公司；超純水：實驗室自制；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1GB-NLC制備采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備GB-NLC。具體步驟如下：稱取處方量單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、中鏈甘油三酯、卵磷脂和GB原料藥，加乙醇和丙酮混合溶液溶解，作為有機相。稱取處方量吐溫80，加入到純水中，作為水相。待水相加熱至恒定溫度后，將有機相緩慢加入到水相中，并保持恒定速率攪拌，得初乳。再將初乳迅速倒入冰水中持續(xù)攪拌一段時間，得GB-NLC溶液。移除GB原料藥，按上述方法制備可得空白NLC溶液。

2.2微觀形態(tài)觀察取適量GB-NLC溶液，滴加數(shù)滴于干凈的銅片之上，自然揮干之后，在銅片上進行鍍金以增加導電性，置于掃描電鏡下觀察微觀形態(tài)并拍照，結(jié)果見圖1。

2.3粒徑及Zeta電位測定取適量GB-NLC溶液，用蒸餾水稀釋后，在室溫條件下，用納米激光粒度儀測定粒徑及Zeta電位。樣品平行測定3次。結(jié)果表明，平均粒徑為(173.10±5.84)nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)=(0.22±0.01)(n=3)，平均Zeta電位為(-27.47±0.40)mV(n=3)。

2.4GB含量測定方法

2.4.1質(zhì)譜條件采用ESI-離子源，多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式掃描。GB：m/z423.1→366.9；去簇電壓(decluster potential，DP)：-100 V；碰撞能(collision energy，CE)：-25 eV。GLY：m/z491.9→169.6；DP：-140 V；CE：-38 eV。

2.4.2色譜條件色譜柱：Waters ACQUITYTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相為甲醇∶超純水(75∶25)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積1 μL，得到色譜圖。見圖2。

2.4.3供試品制備精密稱取GB標準品和GLY標準品，分別置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得GB儲備液及GLY儲備液。取GLY儲備液，用甲醇稀釋至100 ng/mL作為內(nèi)標溶液。取GB儲備液，分別用甲醇稀釋至不同濃度(低、中、高濃度分別為20、50、160 ng/mL)作為質(zhì)控樣品。上述溶液配置完成后全部放置在4 ℃冰箱中備用。

2.4.4專屬性分別配置GB標準品溶液(50 ng/mL)、GLY標準品溶液(100 ng/mL)、空白NLC溶液，及GB、GLY和空白NLC混合溶液，將空白NLC溶液及GB、GLY和空白NLC混合溶液用適量甲醇破乳后進樣。結(jié)果表明,NLC制備材料對GB和GLY測定無干擾。

2.4.5標準曲線取GB儲備液用甲醇稀釋為濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的系列溶液，分別按體積比3∶1加入內(nèi)標溶液，混勻后進樣，并分別計算GB、GLY峰面積。以GB與GLY峰面積之比(R)為縱坐標，濃度(c)為橫坐標，R對c進行線性回歸，得標準曲線。線性回歸方程為R=0.020 3c+0.022 6，R2=0.999 3，結(jié)果表明，GB在10~200 ng/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積之比與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6精密度按“2.4.3”項下方法配置低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每濃度平行配置5份。分別按體積比3∶1加入內(nèi)標溶液，混勻后進樣，考察日內(nèi)精密度。連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)RSD均小于15%，日間RSD均小于12%。

2.5超濾離心法測定包封率

2.5.1不同截留分子量選擇按“2.4.3”項下方法配置GB溶液(50 ng/mL)，分別向截留分子量為3、10、100 kD的超濾離心管中加入1 mL GB溶液，3 000 r/min離心10 min，收集濾液。將超濾前后GB溶液分別按體積比3∶1加入內(nèi)標溶液，混勻后進樣測定，計算不同截留分子量的超濾管對GB回收率影響。結(jié)果表明，GB溶液經(jīng)3、10、100 kD超濾離心管超濾后回收率分別為(95.47±1.78)%、(101.32±3.93)%、(99.38±4.97)%，RSD(n=3)分別為1.87%、3.88%、5.00%。

2.5.2膜吸附率測定按“2.4.3”項下方法配置低、中、高濃度GB溶液，分別取1 mL加入超濾離心管(截留分子量：100 kD)中，3 000 r/min離心10 min，得濾液。將超濾前后GB溶液分別按體積比3∶1加入內(nèi)標溶液，混勻后進樣測定，計算超濾膜對不同濃度GB吸附程度。結(jié)果表明，低、中、高濃度樣品在超濾膜平均回收率分別為(103.70±6.78)%、(102.68±11.52)%、(98.73±4.85)%，RSD(n=3)分別為6.53%、11.22%、4.91%。

2.5.3加樣回收率按“2.4.3”項下方法配置低、中、高濃度GB溶液，與等體積空白NLC溶液混勻，取1 mL加入超濾離心管(截留分子量：100 kD)中，3 000 r/min離心10 min，得濾液。將超濾前后GB溶液分別按體積比3∶1加入內(nèi)標溶液，混勻后進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果表明，低、中、高濃度樣品平均回收率分別為(101.93±4.89)%、(99.65±6.47)%、(102.50±6.58)%，RSD(n=3)分別為4.80%、6.49%、6.42%。

3討論

本實驗采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制得GB-NLC，從掃描電鏡結(jié)果可以看出，制得的載藥NLC多為類球形，粒徑分布在100~200 nm之間，部分粘連可能是由于原始GB-NLC溶液未經(jīng)稀釋就進行烘干并拍攝導致。所測平均粒徑為(173.10±5.84)nm，與掃描電鏡結(jié)果相符，PDI=(0.22±0.01)(n=3)，表明分散性良好。測得平均Zeta電位為(-27.47±0.40)mV(n=3)，通常認為當納米粒Zeta電位絕對值位于30 mV附近時有較好的穩(wěn)定性。

超濾離心法被認為是測定包封率較為常用的方法。由于超濾膜對有機溶劑的耐受性有限，對于脂溶性強的藥物，游離藥物因在水中析出而堵塞超濾管，因此超濾離心法多用于具有一定水溶性藥物的包封率測定。研究[12]表明，GB的脂水分配系數(shù)(lgP)為0.59，表明GB具有一定的水溶性，可用此方法進行后續(xù)試驗。本實驗首先考察了不同截留分子量的超濾管對GB回收率的區(qū)別，結(jié)果表明，GB在3種不同截留分子量的超濾離心管上回收率都大于95%。通過查閱資料[13]可知，截留分子量為100 kD的超濾膜，其膜孔平均直徑為5.5 nm，已足夠攔截制備的GB-NLC，考慮到較小截留分子量的超濾管使用過程中容易堵塞，因此選取截留分子量為100 kD的超濾管為后續(xù)實驗所用。而膜吸附率實驗和加樣回收率實驗結(jié)果則表明，無論是超濾離心管還是空白NLC對低、中、高濃度的GB溶液皆無明顯吸附。

因此，采用超濾離心法測定GB-NLC包封率可獲得重復性較好、準確度較高的結(jié)果，為GB-NLC處方優(yōu)化提供支持。

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·方藥研究·

Centrifugal Ultrafiltration Technique for Determining Entrapment Efficiency of Ginkgolide B-loaded Nanostructured Lipid Carriers

ZHOUKai1,YAOLiang1,DAIHao-zhi1,LINTong-yuan1,ZHUTing-ting1,XINGRong2,CHENWei-dong1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233000,China)

收稿日期：(2014-08-11；編輯：曹健)

通信作者：陳衛(wèi)東，anzhongdong@126.com

作者簡介：周愷(1988-)，男，碩士研究生

[中圖分類號]R944[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.023

Effects of Aqueous Extract ofAcorustatarinowiion PC12 Cell Proliferation and Processes

YAONa1,2,LIANGMi2,LINSen-xiang2,ZHANGQi2,TANYan2,WANGXu2,WANGShu-yan2,HUAQian2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,TianjinBloodCenter,Tianjin300110,China; 2.SchoolofBasicMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)