不同磷肥水平對甘蔗脯氨酸合成積累及關(guān)鍵基因表達(dá)的效應(yīng)

楊　善，葉昌輝，莫俊杰，黃　興，楊杰文，周鴻凱(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088)

不同磷肥水平對甘蔗脯氨酸合成積累及關(guān)鍵基因表達(dá)的效應(yīng)

楊善，葉昌輝，莫俊杰，黃興，楊杰文，周鴻凱
(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088)

摘要:【目的】探索不同磷肥量對甘蔗脯氨酸的合成積累影響，以闡明磷肥對甘蔗脯氨酸合成積累及其耐旱性的作用效應(yīng).【方法】以甘蔗栽培種粵糖55為研究材料，用桶栽試驗(yàn)法，在正常水分和干旱脅迫條件下，測定4個磷肥施用水平的甘蔗植株內(nèi)P5CS、δ-OAT基因表達(dá)和酶活性、以及游離脯氨酸、葉綠素含量等生理生化指標(biāo).【結(jié)果和結(jié)論】無論是在正常供水條件下還是干旱脅迫下，甘蔗P5CS、δ-OAT基因的表達(dá)及酶活性、游離脯氨酸含量均受到N、P、K配比的影響.當(dāng)施用過磷酸鈣為900 kg·hm－2時，正常水分條件下，P5CS、δ-OAT酶活性均處于較低的水平，植株游離脯氨酸含量最低;干旱脅迫下，P5CS酶活性最高，δ-OAT酶活性亦處于較高水平，植株游離脯氨酸含量增加到最大.基于本研究的結(jié)果，湛江磚紅壤蔗地的最佳N、P、K肥搭配方案是尿素、過磷酸鈣、氯化鉀的用量分別為918、900、750 kg·hm－2.相關(guān)、偏相關(guān)及通徑分析的結(jié)果表明，干旱脅迫下植株中P5CS對游離脯氨酸的合成積累貢獻(xiàn)顯著大于δ-OAT;干旱脅迫下甘蔗合成積累游離脯氨酸的途徑是以谷氨酸途徑(Glu→Pro)為主，鳥氨酸途徑(Orn→Pro)為輔.

關(guān)鍵詞:甘蔗;磷肥用量;脯氨酸含量; P5CS;δ-OAT;基因表達(dá);干旱脅迫

楊善，葉昌輝，莫俊杰，等.不同磷肥水平對甘蔗脯氨酸合成積累及關(guān)鍵基因表達(dá)的效應(yīng)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36(6):68-75.

優(yōu)先出版時間:2015-10-16

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我國蔗區(qū)主要分布在廣西、廣東、云南、海南等南方黃、紅壤地區(qū)，90%以上的種植面積為缺乏灌溉的旱坡地.甘蔗Saccharum officinarum L.為禾本科甘蔗屬植物，屬C4作物，其對溫度、水分要求較嚴(yán)格(年積溫需5 500℃以上、年降水量要求800 mm以上)，從種苗發(fā)芽、發(fā)根、幼苗生長、分蘗、伸長、糖分積累到成熟，整個生育過程都要消耗大量水分［1］.因此，季節(jié)性干旱已成為限制我國甘蔗生產(chǎn)的首要環(huán)境因素，也成為了制約我國蔗糖生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一.

植物受到干旱、低溫、高鹽、重金屬等脅迫下，會直接或間接地發(fā)生水分脅迫，為了適應(yīng)逆境，植物體內(nèi)會在短時間內(nèi)迅速大量地合成和積累如脯氨酸(Pro)、甜菜堿等一系列滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［2］.其中，脯氨酸是分布最廣、水溶性最大的氨基酸，具有較強(qiáng)的水合能力.在高等植物中因脯氨酸代謝的初始底物不同其合成的途徑也不盡相同，一般分為谷氨酸(Glu)途徑［3］和鳥氨酸(Orn)途徑［4］，而每一個途徑都受到關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，它們的關(guān)鍵酶分別是△1－毗咯琳－5－羧酸合成酶(P5CS)和δ－鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)［5-6］.脯氨酸合成積累途徑在不同植物、不同生理?xiàng)l件以及不同組織器官中各不相同.Roosens等［7］研究不同生育期植物脯氨酸積累途徑發(fā)現(xiàn)，幼小植株以O(shè)rn途徑為主，成年植株以Glu途徑為主，而在滲透脅迫條件下2條途徑發(fā)揮同樣重要的作用.錢大文等［8］的研究認(rèn)為，NaCl脅迫下海馬齒植株內(nèi)游離脯氨酸合成積累的2個途徑均被啟動和發(fā)生作用，并表現(xiàn)出以Glu→Pro途徑為主、Orn→Pro途徑為輔.黃誠梅等［9］的研究表明，在PEG處理下甘蔗伸長期葉中脯氨酸生物合成中谷氨酸→脯氨酸途徑比精氨酸→鳥氨酸→脯氨酸途徑更占優(yōu)勢地位.

磷素(P)在植物體內(nèi)的作用極為重要，參與生物膜、原生質(zhì)和細(xì)胞核的構(gòu)成，參與ATP等的能量代謝［10］.在正常水分條件下，P對作物的生長發(fā)育、光合作用等生理過程具有顯著作用［11］.在旱地施肥增產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用中，P肥的效果明顯，P能提高原生質(zhì)膠體的水合度和細(xì)胞機(jī)構(gòu)的充水度，使其維持膠體狀態(tài)，并能增加原生質(zhì)的黏度和彈性，因而增強(qiáng)了原生質(zhì)抵抗脫水的能力［12］.趙海超等［13］認(rèn)為增施P肥可以促進(jìn)根系生長、優(yōu)化營養(yǎng)分配、提高根系活力、降低丙二醛含量、提高超氧化物歧化酶活性，從而提高馬鈴薯的抗旱性，但施P量過高會降低馬鈴薯的抗旱性.前人有許多關(guān)于不同施肥量對甘蔗產(chǎn)量、生長性狀的影響研究［14-16］，也有很多關(guān)于甘蔗脯氨酸積累的研究［17-18］，但是，針對干旱脅迫下，不同P肥施用量對甘蔗植株體內(nèi)的脯氨酸合成積累關(guān)鍵基因P5CS、δ-OAT表達(dá)和酶活性的變化，以及脯氨酸合成積累途徑的研究鮮見報道.本文以甘蔗品種粵糖55為研究材料，在正常水分生長和干旱脅迫條件下，測定4個P肥施用水平的甘蔗植株內(nèi)P5CS、δ-OAT基因表達(dá)和酶活性、以及游離脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)，以闡明P肥對甘蔗植株脯氨酸合成積累及耐旱性的作用效應(yīng)，為甘蔗耐旱高效栽培提供理論參考.

1　材料與方法

1.1材料

甘蔗品種為粵糖55，粵西蔗區(qū)主栽品種之一.

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)生物研究所進(jìn)行.桶栽試驗(yàn):塑料桶高50 cm、口徑40 cm，桶下端10 cm處的側(cè)面開4個排水小孔，每桶裝磚紅壤土25 kg，每桶種植1個雙芽苗.土壤肥力狀況: pH 5. 08，堿解氮152. 12 mg·kg－1、速效鉀158. 56 mg·kg－1、有效磷53. 27 mg·kg－1、有機(jī)質(zhì)27. 80 g·kg－1.在施用尿素918 kg·hm－2和鉀肥(KCl) 750 kg·hm－2的水平上(為粵西蔗區(qū)通常施N、K肥水平)，設(shè)置4個過磷酸鈣施用水平: 0(CK)、900、1 800、2 700 kg·hm－2;設(shè)置2個生長條件: 1)土壤含水量＞18%作為正常條件; 2)土壤含水量＜8%時(甘蔗出現(xiàn)枯萎)作為干旱脅迫.隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù).

2013年6月18日開始種植，按計(jì)劃施肥量施用全量的磷肥、半量的氮肥和鉀肥，肥料與土壤充分混勻，施肥在20～30 cm土層內(nèi)，齊苗后定苗，每桶選留對稱且健壯的2株甘蔗幼苗，每隔2 d澆1次水，保持土壤濕潤;于2013年9月10日追肥，將計(jì)劃施肥量的另一半氮肥和鉀肥全部施入.2013年11月30日，實(shí)測土壤含水量(w)為18. 65%±0. 32%時，每桶取1株甘蔗苗進(jìn)行測試分析，采集其－1葉進(jìn)行脯氨酸含量、δ-OAT酶活性、P5CS酶活性的測定，取心葉進(jìn)行總RNA提取.然后，將試驗(yàn)桶栽甘蔗移入玻璃溫室內(nèi)，停水管理6 d進(jìn)行干旱脅迫處理，當(dāng)甘蔗葉片開始出現(xiàn)萎蔫時［2013年12月6日，實(shí)測土壤含水量(w)為7. 35%±0. 27%］按上述方法取樣、測試分析.

1.3試驗(yàn)指標(biāo)的測定和引物設(shè)計(jì)

脯氨酸含量的測定按Bates等［19］的方法; P5CS提取方法依照Kavi等［20］的方法，其活性測定參照黃誠梅［21］的方法以每分鐘生成1 μmol γ－谷氨酰胺所需要的酶量為一個酶活性單位(U) ;δ-OAT的抽提按照Delauney等［4］的方法，其活性測定參照Kim等［22］的方法進(jìn)行，以每小時生成1 mmol P5C所需要的酶量為一個酶活性單位(U) ;葉片色素含量提取采用乙醇－丙酮混合液浸泡法［23］;總引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;實(shí)時熒光定量PCR (RT-qPCR)用TaKaRa寶生物公司的SYBR?Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑盒，操作步驟參照說明書;儀器使用Roche LightCycler?2. 0;基因表達(dá)分析采用2－△△CT法［24］進(jìn)行分析，以正常水分條件下的基因表達(dá)量定義為1.

引物設(shè)計(jì):采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5. 0，按照GenBank中甘蔗P5CS基因的cDNA序列(EU005373. 2)、甘蔗δ-OAT基因的cDNA序列(EF517495. 1)，并根據(jù)RT-qPCR的引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終篩選引物特異性好、沒有引物二聚體的引物: 1) P5CS的引物，F(xiàn): 5'-GTGGGTGTTGAAGGTCTC-3'，R: 5'-AGGAAGGTTCTTATGGGT-3'; 2)δ-OAT的引物，F(xiàn): 5'-GAGTTTAGGGACCAGTTACAGAA-3'，R: 5'-AAGCAGGAGATAGAGCGTCAT-3'.其中，內(nèi)參基因引物則引用闕友雄等［25］篩選的25SrRNA引物，F(xiàn): 5'-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3'，R: 5'-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3'.

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS10. 3在PC機(jī)上進(jìn)行，用Duncan’s法測定不同磷肥施用處理間的生理指標(biāo)的差異顯著性.

2　結(jié)果與分析

2.1不同磷肥水平甘蔗游離脯氨酸含量

如圖1可知，在正常情況下，甘蔗體內(nèi)游離脯氨酸的含量不高，但不同處理間差異顯著，說明磷肥對脯氨酸含量的影響顯著，不施磷肥(CK)時，脯氨酸含量最大，而脯氨酸含量最小為施磷肥900 kg·hm－2的處理.干旱脅迫時，甘蔗植株體內(nèi)游離脯氨酸含量大幅增加，其中CK的脯氨酸含量最小，且與其他水平差異顯著;施磷肥900 kg·hm－2時脯氨酸的含量最大，且顯著高于1 800和2 700 kg·hm－2處理的脯氨酸含量.

在正常水平下，CK的脯氨酸含量是施磷肥900 kg·hm－2的1. 99倍，說明磷肥不足會影響甘蔗的正常生長，出現(xiàn)磷脅迫，使得脯氨酸的含量增加.干旱脅迫時，甘蔗體內(nèi)脯氨酸的合成積累效應(yīng)顯著，與正常水分時相比，平均增幅為290. 85 μg·g－1;磷肥水平900 kg·hm－2時，脯氨酸的含量最高，效應(yīng)最明顯，為最佳施磷肥量.

2.2不同磷肥水平甘蔗P5CS酶活性變化

P5CS作為合成脯氨酸中谷氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，其活性變化將直接影響脯氨酸合成積累的效應(yīng).從圖2中可看出，在正常水分或干旱脅迫下，在4個磷肥處理間P5CS的活性變化趨勢類似，但在干旱脅迫下的P5CS活性明顯增大，尤其是在磷肥水平900 kg·hm－2最為明顯，干旱脅迫時是正常水平時的1. 3倍.P5CS活性在不施磷肥時最低，在磷肥水平900 kg·hm－2時活性最高，隨后急劇下降.

正常水分情況下，4個磷肥水平的P5CS活性平均為21.3 U·g－1·min－1，干旱脅迫時為25.63 U·g－1·min－1，平均變化幅度為4.33 U·g－1·min－1.這一結(jié)果表明，干旱脅迫下甘蔗P5CS活性顯著地被激活，尤其是在磷肥水平900 kg·hm－2時.

圖2　不同磷肥水平P5CS酶活性的變化Fig.2　 The changes of P5CS enzyme activities at different phosphorus levels

2.3不同磷肥水平甘蔗δ-OAT酶活性變化

從圖3中可知，無論正常水分或者干旱脅迫下，δ-OAT活性都是隨磷肥施用量增加而增強(qiáng).除2 700 kg·hm－2處理外，不同磷肥水平下正常水分與干旱脅迫間的δ-OAT活性均有顯著性差異.說明干旱脅迫下，甘蔗植株δ-OAT活性有增強(qiáng)的趨勢，其平均增幅為1. 52 U·g－1·h－1.

圖3　不同磷肥水平δ-OAT酶活性的變化Fig.3 The changes of δ-OAT enzyme activities at different phosphorus levels

2.4不同磷肥水平甘蔗葉綠素含量

從圖4可知，在正常水分或干旱脅迫下，4個磷肥處理間葉綠素(Chl)含量變化趨勢類似，但在干旱脅迫下的葉綠素含量明顯降低，平均下降率為13. 3%.表明在較為嚴(yán)重的干旱脅迫下，甘蔗葉片的葉綠素含量顯著降低，進(jìn)而影響甘蔗的光合作用能力.但在正常水分或干旱脅迫下，4個磷肥處理間甘蔗葉片葉綠素含量均以900 kg·hm－2時最大.表明在湛江磚紅壤種植甘蔗時，過磷酸鈣的施用量為900 kg·hm－2最有利于甘蔗葉片葉綠素的合成，從而促進(jìn)甘蔗的光合作用.

圖4　不同磷肥水平葉片葉綠素含量的變化Fig.4　 The changes of leaf chlorophyll contents at different phosphorus levels

2.5生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.5.1簡單相關(guān)和偏相關(guān)分析從表1可知，正常供水情況下，脯氨酸含量(Y)與δ-OAT活性(X1)、P5CS活性(X2)、葉綠素含量(X3)之間均表現(xiàn)為負(fù)簡單相關(guān)，且與X2、X3相關(guān)達(dá)極顯著水平; X2與X3之間呈極顯著水平的正簡單相關(guān)性.偏相關(guān)結(jié)果表明，X3與X2之間呈顯著的正偏相關(guān)，其他指標(biāo)間偏相關(guān)均未達(dá)顯著水平.

表1　正常水分下生理指標(biāo)間的簡單和偏相關(guān)分析1)Tab.1 Simple and partial correlation analyses of physiological parameters at the normal water level

從表2可看出，干旱脅迫下，Y與X1、X2、X3之間均表現(xiàn)為正簡單相關(guān)，除X1與X2、X1與Y外，均達(dá)到顯著或極顯著水平.偏相關(guān)分析結(jié)果表明，X2與Y達(dá)極顯著正向偏相關(guān)，X1與X2達(dá)極顯著負(fù)向偏相關(guān).表明在干旱脅迫下，P5CS的活性與脯氨酸含量間不僅具有極顯著水平的簡單相關(guān)性，還有極顯著水平的偏相關(guān)性;脯氨酸合成積累的2個關(guān)鍵酶P5CS和δ-OAT之間表現(xiàn)為極顯著水平的負(fù)向偏相關(guān).

表2　干旱脅迫下個生理指標(biāo)間的簡單和偏相關(guān)性分析Tab.2 Simple and partial correlation analyses of physiological parameters under drought stress

2.5.2通徑分析從表3中可知，正常水分條件下，X1、X2、X3對Y的直接通徑系數(shù)均為負(fù)數(shù)，且僅有X2對Y的直接通徑系數(shù)達(dá)到顯著水平.剩余通徑系數(shù)較大，為0. 328 9，說明在正常水分條件下，植株游離脯氨酸的合成積累受其他隨機(jī)因素的影響較大.

表3　正常水分下X1、X2和X3對Y的通徑分析1)Tab.3 The path analyses of X1，X2and X3to Y at the normal water level

從表4可以發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，在3個直接通徑系數(shù)中，只有X2對Y的直接通徑系數(shù)達(dá)到了顯著水平;同時，葉綠素含量通過P5CS活性對脯氨酸含量的間接通徑系數(shù)也達(dá)到了顯著水平;剩余通徑系數(shù)僅有0. 059 3，說明在本研究條件下，隨機(jī)因子對脯氨酸合成積累量的影響較小.可見，在δ-OAT活性、P5CS活性和葉綠素含量3個因素中，P5CS活性對脯氨酸含量的直接和間接作用均最大，即在干旱脅迫下，甘蔗植株P(guān)5CS活性對其脯氨酸合成積累量的影響最為重要.

表4　干旱脅迫下X1、X2和X3對Y的通徑分析1)Tab.4　 The path analyses of X1，X2and X3to Y under drought stress

2.6實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

2.6.1總RNA提取結(jié)果驗(yàn)證及引物篩選對提取的總RNA經(jīng)10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S 這2條帶清晰完整，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象(圖5)，表明總RNA樣品比較完整，沒有明顯降解.紫外分光光度計(jì)法檢測RNA濃度表明，D260 nm/D280 nm比值在1. 8～1. 9之間，表明其RNA純度與濃度達(dá)到合成cDNA第1鏈的要求.

用上述P5CS、δ-OAT的引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，并用30 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳，得到的PCR產(chǎn)物條帶單一，沒有引物二聚體出現(xiàn)，片段大小符合熒光定量PCR的要求(圖6).同時，回收PCR產(chǎn)物并送生工公司測序，通過Blast比對為目的基因片段.可以做下一步的RT-qPCR.

圖5　葉片總RNA電泳圖Fig.5 Electrophoresis of total RNA of leaves

圖6　P5CS和δ-OAT的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis of the PCR products of P5CS and δ-OAT

2.6.2 P5CS、δ-OAT的基因表達(dá)分析從圖7可知，隨著施磷水平的增加，P5CS和δ-OAT基因相對于正常水分條件下的表達(dá)量均呈現(xiàn)遞增的趨勢.不施磷肥時，2個基因的相對表達(dá)量都最小，分別為1. 48和4. 03，而施磷水平2 700 kg·hm－2時，兩者的基因相對表達(dá)量最大，分別為20. 96和35. 89.表明磷肥的施用量影響P5CS、δ-OAT基因的表達(dá).

圖7　干旱脅迫下甘蔗葉片中P5CS、δ-OAT基因的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expressions of P5CS and δ-OAT genes in sugarcane leaves under drought stress

3　討論與結(jié)論

3.1不同磷肥施用水平對甘蔗脯氨酸合成積累效應(yīng)

在固定施用尿素918 kg·hm－2和鉀肥(KCl) 750 kg·hm－2時，在水分供應(yīng)正常的情況下，N、P、K肥之間的配比合理(磷肥水平900 kg·hm－2時)能使甘蔗植株正常生長，體內(nèi)各項(xiàng)生理代謝平衡，細(xì)胞內(nèi)沒有產(chǎn)生滲透壓，合成脯氨酸的2個關(guān)鍵酶P5CS和δ-OAT活性較小，沒有被顯著激活，同時脯氨酸含量也處于低水平.隨著磷肥施用量的增加，脯氨酸含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，P5CS酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，δ-OAT酶活性則呈現(xiàn)一直增加的趨勢，說明脯氨酸合成的2個關(guān)鍵酶P5CS和δ-OAT的活性與脯氨酸含量的變化趨勢不一致性.相關(guān)研究表明，除了脯氨酸的合成酶外，還有其他的一些酶如脯氨酸運(yùn)輸酶［26］、谷氨酰胺合成酶［27］等也參與了脯氨酸的積累過程.但是，當(dāng)N、P、K肥之間的配比不合理時，即使水分供應(yīng)正常，也致使甘蔗植株生長代謝異常，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生滲透脅迫，表現(xiàn)為游離脯氨酸含量顯著增加，以抵抗由于N、P、K肥之間的配比不合理所產(chǎn)生的滲透壓，保證甘蔗植株的正常生長.

干旱脅迫不同程度地激活了P5CS和δ-OAT基因的表達(dá)以及P5CS和δ-OAT酶活性，從而使得脯氨酸含量急劇增加，以緩解干旱脅迫所造成的細(xì)胞滲透壓力，維持體內(nèi)正常的生理代謝平衡，減少干旱脅迫帶來的不利影響.同時磷肥的施用量對P5CS和δ-OAT基因的表達(dá)、P5CS和δ-OAT酶活性、脯氨酸含量有顯著的影響.本研究中，當(dāng)磷肥施用量大于900 kg·hm－2時，脯氨酸含量和P5CS酶活性都呈現(xiàn)下降趨勢，而δ-OAT酶活性則呈現(xiàn)一直增加的趨勢，P5CS、δ-OAT基因的相對表達(dá)量也呈增長趨勢.由此可推測磷素的增加有利于P5CS、δ-OAT基因的表達(dá)，從而有利于P5CS和δ-OAT的合成，促使其活性的提高，特別是δ-OAT基因?qū)α姿氐捻憫?yīng)較為明顯.但是P5CS基因的表達(dá)量與其對應(yīng)酶的活性不一致，可能是由于基因從表達(dá)到成功翻譯受到許多因子調(diào)控［28］，比如在蛋白質(zhì)水平上存在鈍化蛋白［29］、相關(guān)降解酶對酶活性進(jìn)行調(diào)控而產(chǎn)生差異.譚彩霞等［30］認(rèn)為小麥中GBSS基因的相對表達(dá)量與GBSS酶活性間相關(guān)不顯著是由于GBSS基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄后調(diào)控.這些相關(guān)的調(diào)控機(jī)理有待于進(jìn)一步的探究.

在N、K肥施用量分別為918、750 kg·hm－2水平時，無論是在正常水分條件下還是在干旱脅迫下，4個過磷酸鈣的施用水平間，甘蔗植株中P5CS和δ-OAT基因的表達(dá)、P5CS和δ-OAT酶活性以及游離脯氨酸的含量均有明顯的差異，表明磷肥的施用量影響植物生理生化過程和植株體內(nèi)的代謝平衡，從而影響植株生長發(fā)育.當(dāng)過磷酸鈣的施用水平為900 kg·hm－2時，正常水分條件下，甘蔗植株脯氨酸含量最低，P5CS與δ-OAT酶活性亦處于較低的水平;而在干旱脅迫下，甘蔗植株游離脯氨酸的含量最大，P5CS活性最大，δ-OAT酶活性也處于較高水平，P5CS和δ-OAT基因的相對表達(dá)量分別為2. 63和11. 39.因此，本研究中的磚紅壤基于甘蔗植株游離脯氨酸合成積累的最佳施肥方案是尿素、過磷酸鈣、氯化鉀的用量分別為918、900、750 kg·hm－2.

3.2不同磷肥施用水平對甘蔗脯氨酸的合成積累途徑的影響

高等植物體內(nèi)脯氨酸的合成積累有谷氨酸(Glu)途徑和鳥氨酸(Orn)途徑，P5CS和δ-OAT酶分別是這2個途徑的關(guān)鍵酶［3-6，31-33］.王麗媛等［34］的研究認(rèn)為通常在植物受到脅迫或氮素缺乏的情況下，脯氨酸的主要來源是谷氨酸合成途徑;在氮素供應(yīng)充足的情況下，脯氨酸合成的主要途徑則是鳥氨酸途徑.曹芳等［35］研究發(fā)現(xiàn)脅迫條件下硝酸鉀可以增加煙草葉片中的脯氨酸含量，PEG脅迫下硝酸鉀能增強(qiáng)鳥氨酸代謝途徑中δ-OAT酶活性.由此表明，大量的礦質(zhì)元素可以影響植物脯氨酸的合成積累途徑.

本研究在固定施用尿素918 kg·hm－2和鉀肥(KCl) 750 kg·hm－2水平時，過磷酸鈣設(shè)置4個施入水平，在干旱脅迫下，甘蔗植株體內(nèi)的P5CS、δ-OAT基因表達(dá)及其酶活性被不同程度地激活，從而合成積累大量的脯氨酸，這顯然是谷氨酸途徑(Glu→Pro)和鳥氨酸途徑(Orn→Pro)共同作用的結(jié)果.相關(guān)、偏相關(guān)分析表明，在干旱脅迫下，植株游離脯氨酸含量與P5CS酶活性的簡單相關(guān)系數(shù)及偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平，而Pro含量與δ-OAT酶活性間均未達(dá)到顯著水平;通徑分析中P5CS酶活性對Pro含量的直接通徑系數(shù)達(dá)到了顯著水平，δ-OAT酶活性對Pro含量的直接通徑系數(shù)未達(dá)顯著水平.說明干旱脅迫下甘蔗植株中P5CS酶活性對游離脯氨酸的合成積累貢獻(xiàn)最大，此時甘蔗植株合成積累游離脯氨酸的途徑是以谷氨酸途徑(Glu→Pro)為主，鳥氨酸途徑(Orn→Pro)為輔.這一結(jié)果與姜淑欣等［36］以小麥為材料、Choudhary等［37］以水稻為材料、黃誠梅等［9］以甘蔗為材料的研究結(jié)果相似.在正常水分條件下，植株游離脯氨酸含量與P5CS和δ-OAT酶活性、葉綠素含量的簡單相關(guān)、偏相關(guān)均呈負(fù)相關(guān);通徑分析中也均為負(fù)向貢獻(xiàn); P5CS酶活性與脯氨酸含量的簡單相關(guān)系數(shù)、直接通徑系數(shù)達(dá)到了顯著水平，偏相關(guān)系數(shù)的絕對值也較δ-OAT酶活性與脯氨酸含量間的大.由此推測，在正常供水情況下，P5CS酶活性對植株游離脯氨酸的合成調(diào)節(jié)作用比較大.此外，通徑分析中剩余通徑系數(shù)較大，為0. 328 9，說明正常水分供應(yīng)下，甘蔗植株的游離脯氨酸合成積累還受到其他一些因素的調(diào)節(jié)，推斷應(yīng)為降解通徑的一些相關(guān)酶，如脯氨酸降解酶的調(diào)節(jié)［9，26］.

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【責(zé)任編輯周志紅】

Effects of different phosphorus levels on proline biosynthesis and accumulation and key gene expression in sugarcane

YANG Shan，YE Changhui，MO Junjie，HUANG Xing，YANG Jiewen，ZHOU Hongkai
(College of Agriculture，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

Abstract:【Objective】Different phosphorus(P) fertilizer rates were applied to clarify the effect of P fertilizer on proline biosynthesis and accumulation and drought-resistance in sugarcane.【Method】Sugarcane variety YT-55 was used as the plant material for barrel experiment.Under the normal and drought conditions，four P levels were designed.The physiological and biochemical indexes such as the expressions of P5CS and δ-OAT genes，enzyme activities and the contents of free proline and chlorophyll were determined.【Result and conclusion】The expressions of P5CS and δ-OAT genes，enzyme activities and the free proline content were affected by the ratios of N，P and K fertilizers under the normal and drought conditions.When the P level was 900 kg·hm－2，both P5CS and δ-OAT activities were relatively low，and the free proline content was the lowest in the plants under the normal water condition.The P5CS activity was the highest; the δ-OAT activity was also at a high level; and the free proline content was up to thebook=69,ebook=341maximum amount under drought stress.Based on the results，the optimum levels of N，P and K fertilizers are 918 kg·hm－2urea，900 kg·hm－2calcium superphosphate and 750 kg·hm－2potassium chloride in Zhanjiang lateritic soil.The results of correlation，partial correlation and path analysis indicated that the P5CS was more effective than δ-OAT in free proline biosynthesis and accumulation of sugarcane under drought stress.The main pathway of free proline biosynthesis and accumulation is glutamic acid pathway (Glu→Pro) supplemented by ornithine pathway (Orn→Pro) under drought stress.

Key words:sugarcane; phosphorus application rate; proline content;δ-OAT; P5CS; gene expression; drought stress

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(41073059) ;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020301005，2013B020301008，2010B020302008) ;廣東省良種培育和引進(jìn)專項(xiàng)(201201148)

作者簡介:楊善(1987—)，男，碩士研究生，E-mail: 116168836@ qq.com;通信作者:周鴻凱(1962—)，男，教授，E-mail: 897961801@ qq.com

收稿日期:2015-03-23

文章編號:1001-411X(2015) 06-0068-08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S566.1