苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

陳麗君，劉明騫，廖柏勇，鄧小梅，陳曉陽(廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東廣州50642; 2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地管理中心，廣東廣州50642)

苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

陳麗君1，2，劉明騫1，廖柏勇1，鄧小梅1，陳曉陽1
(1廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東廣州510642; 2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地管理中心，廣東廣州510642)

摘要:【目的】應(yīng)用SRAP技術(shù)對苦楝Melia azedarach遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定等開展研究，對苦楝SRAP-PCR體系中的模板DNA、dNTPs、Mg2 +、引物和Taq DNA聚合酶5個組分濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立適合苦楝的SRAP-PCR反應(yīng)體系.【方法】采用單因素試驗對反應(yīng)體系中的5個因素分別設(shè)置8個濃度梯度水平，確定濃度范圍后進(jìn)行L16(45)正交試驗設(shè)計，并對結(jié)果進(jìn)行打分，確定優(yōu)化體系.【結(jié)果和結(jié)論】SRAP對苦楝DNA濃度的要求不高，有一個較寬的濃度適宜范圍; dNTPs在0.1～0.2 mmol·L－1范圍內(nèi)，能擴(kuò)增出條帶基本相同的清晰譜帶; Mg2 +為2.0 mmol·L－1左右時擴(kuò)增條帶較清晰且數(shù)量多;引物介于0.48～0.64 μmol·L－1均能擴(kuò)增出帶型基本保持一致且清晰的譜帶; Taq DNA聚合酶在0.50～2.00 U范圍內(nèi)可以得到清晰的帶型.根據(jù)正交試驗設(shè)計16個處理的得分，確定優(yōu)化的反應(yīng)體系為:模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L－1、Mg2 +2.25 mmol·L－1、引物0.48 μmol·L－1、Taq DNA聚合酶0.75 U，反應(yīng)總體積25 μL.

關(guān)鍵詞:苦楝; SRAP-PCR;體系優(yōu)化;正交試驗設(shè)計

陳麗君，劉明騫，廖柏勇，等.苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36(3) : 104-108.

優(yōu)先出版時間:2015-04-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0939.016.html

Key words: Melia azedarach; SRAP-PCR; optimization; orthogonal design

苦楝Melia azedarach又名翠樹、楝樹、紫花樹、森樹等，為楝科楝屬落葉喬木，分布于中國、韓國、日本、印度、斯里蘭卡、印度尼西亞和澳大利亞等地，歐洲、美洲也有栽培［1］.苦楝在我國分布廣泛，水平分布為北緯18°～40°，南至海南省崖縣，北到河北保定和山西運城、陜西渭南、隴南地區(qū)，東至臺灣、沿海各省，西到四川、云南保山［2］.它生長速度快、木材材質(zhì)優(yōu)良、紋理美麗，易加工，可用于家具、建筑、農(nóng)具、船舶、樂器制作等方面，木材抗白蟻、抗蟲蛀、耐腐.苦楝耐煙塵，能大量吸收有毒有害氣體，是優(yōu)良的城市及工礦區(qū)綠化樹種，也是我國南方四旁綠化常用樹種［3-4］.苦楝的根、皮、花、果均可入藥，也可作為植物源農(nóng)藥［5］.遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，SRAP (Sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)結(jié)合了AFLP及RAPD各自的優(yōu)點，方便快速，只需要極少量DNA材料，且不需要預(yù)先知道DNA序列信息，即可快速獲得大量的信息，試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，且再現(xiàn)性較高，重復(fù)性較好［6-7］.目前為止，國內(nèi)對于苦楝的遺傳多樣性分析，鮮見開展過SRAP的研究.本試驗采用單因素和正交試驗設(shè)計從DNA、dNTPs、Mg2 +、引物和TaqDNA聚合酶5個組分濃度對苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，旨在尋找一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗方法，建立適合苦楝的SRAP-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步應(yīng)用SRAP技術(shù)對苦楝群體遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定等研究提供參考［7］.

1　材料與方法

1.1材料

苦楝幼葉于2013年7月取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃，隨用隨采，用于苦楝基因組DNA的提取，采集葉片分別為海南三亞、廣東興寧、廣西梧州、福建建甌、江西南昌、安徽利辛、陜西蒲城、河北邯鄲種源.所用正向引物序列為Me19 (TGAGTCCAAACCGGTTG)和Me27 (TGGGGACAACCCGGCTT)，反向引物序列為Em2 (GACTGCGTACGAATTTGC)、Em4 (GACTGCGTACGAATTTGA)和Em5(GACTGCGTACGAATTAAC).

1.2主要試劑和儀器

用于SRAP-PCR反應(yīng)的Taq酶、dNTPs、Mg2 +為TaKaRa公司產(chǎn)品，引物由北京華大基因研究中心合成，PCR反應(yīng)在東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，DNA濃度和純度使用超微量紫外分光光度計(Thermo Nanodrop 2000)檢測.

1.3基因組DNA的提取

苦楝基因組DNA提取參照上海生工生物工程有限公司柱式基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行.所提取的基因組DNA用8 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測品質(zhì)，并采用超微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，然后將DNA稀釋至50 ng·μL－1，置于－20℃條件下保存?zhèn)溆?

1.4 PCR擴(kuò)增

SRAP-PCR反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán); 94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán); 72℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物采用20 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在自動凝膠圖像分析儀上拍照分析.

1.5 PCR反應(yīng)體系單因素分析

對影響苦楝SRAP-PCR反應(yīng)的主要因素(模板DNA、dNTPs、Mg2 +、引物和Taq酶)進(jìn)行單因子試驗.對各影響因子分別設(shè)置8個梯度處理:模板DNA為0、10、20、30、40、50、60和70 ng; dNTPs為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mmol·L－1; Mg2 +為0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mmol·L－1;引物為0、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56和0.64 μmol·L－1; Taq DNA聚合酶為0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 U.

1.6 PCR反應(yīng)體系的正交試驗

在對影響苦楝SRAP-PCR反應(yīng)的模板DNA、dNTPs、Mg2 +、引物和Taq酶進(jìn)行單因子試驗后采用L16(45)正交試驗設(shè)計，共16個處理，每個處理設(shè)2個重復(fù)，各因素水平見表1.根據(jù)電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色進(jìn)行打分.最優(yōu)的得5分，最差的得1分，并計算每個因素在不同水平下的平均得分［8］.

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗分析

以SRAP-PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳得到的條帶數(shù)目較多且清晰為篩選原則，對反應(yīng)體系中起主要作用的5個因素進(jìn)行單因素濃度梯度篩選試驗［9-12］，每個因素設(shè)置8個濃度梯度.試驗結(jié)果表明:在25 μL反應(yīng)體系中，模板DNA為25～40 ng、dNTPs為0.125～0.200 mmol·L－1、Mg2 +為1.75～2.25 mmol·L－1、引物為0.40～0.52 μmol·L－1、Taq DNA聚合酶為0.50～1.25 U時擴(kuò)增效果好，條帶較多且清晰，故將其選為后續(xù)正交試驗的適宜濃度范圍.

2.2苦楝SRAP-PCR正交反應(yīng)體系的優(yōu)化

以上述單因素試驗確定的各因素適宜濃度范圍為基礎(chǔ)，采用L 16(45)正交設(shè)計對SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化(表1)，并根據(jù)電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色(圖1)對16個處理進(jìn)行打分，打分結(jié)果如表1所示，從2次的得分來看，重復(fù)間差異不大，試驗的一致性較好，其中處理5、處理7、處理8和處理9效果較好，評分均為4分，而處理15效果不好，評分僅為1.0分.從圖2可見，模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L－1、Mg2 +2.25 mmol·L－1、引物0.48 μmol·L－1、Taq DNA聚合酶0.75 U、反應(yīng)總體積25 μL時得分較高，實現(xiàn)最佳擴(kuò)增，確定為最優(yōu)組合.

表1　SRAP-PCR正交試驗設(shè)計L 16(45)及試驗結(jié)果Tab.1 L 16(45) Orthogonal designs and results of SRAP-PCR reaction

圖1　SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗結(jié)果Fig.1 Amplified patterns of the SRAP-PCR based on orthogonal design

圖2　模板DNA、dNTPs、Mg2 +、引物、Taq DNA聚合酶與平均得分的關(guān)系Fig.2 Relationship between concentrations and mean scores of template DNA，dNTPs，Mg2 +，primer and Taq polymerase

2.3苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測

為了驗證體系的準(zhǔn)確性，以來自海南三亞、廣東興寧、廣西梧州、福建建甌、江西南昌、安徽利辛、陜西蒲城、河北邯鄲的8個苦楝種源DNA為模板，選取引物Me27/Em2、Me27/Em4進(jìn)行SRAP-PCR驗證，其結(jié)果如圖3所示，每個種源對每個引物均有清晰的條帶，且不同種源間條帶有差異.由此可見，本試驗建立的SRAP-PCR體系穩(wěn)定可靠，適用于苦楝后續(xù)的SRAP分析.

圖3　SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測Fig.3 The verification of Melia azedarach SRAP-PCR reaction system

3　結(jié)論

本試驗建立并優(yōu)化了適應(yīng)苦楝SRAP-PCR的反應(yīng)體系，前期對苦楝模板DNA、Mg2 +、引物和Taq酶進(jìn)行單因子試驗，研究發(fā)現(xiàn)，SRAP對苦楝DNA濃度的要求不高，有一個較寬的濃度適宜范圍，在25 μL體系中，模板DNA為10～70 ng時都擴(kuò)增出了較清晰、帶型基本相同的譜帶; dNTPs設(shè)計的8個濃度梯度中，0.1～0.2 mmol·L－1范圍內(nèi)能擴(kuò)增出清晰譜帶，且條帶基本相同，濃度低于0.1 mmol·L－1時，擴(kuò)增條帶彌散，高于0.2 mmol·L－1時，出現(xiàn)條帶丟失的現(xiàn)象; Mg2 +為2.00 mmol·L－1左右時擴(kuò)增條帶較清晰且數(shù)量多;引物介于0.48～0.64 μmol· L－1之間均能產(chǎn)生較為清晰的條帶，且?guī)突旧媳３忠恢拢瑮l帶數(shù)并沒有隨著濃度的增加而增加; Taq DNA聚合酶用量在0.50～2.0 U范圍內(nèi)均可以得到清晰的帶型，對其用量要求不高.進(jìn)一步對苦楝SRAP-PCR的反應(yīng)體系進(jìn)行正交試驗，并根據(jù)電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色對16個處理進(jìn)行打分，從2次的得分來看，重復(fù)間差異不大，試驗的一致性較好，其中處理5、處理7、處理8和處理9效果較好，評分均為4.0分，而處理15效果不好，評分僅為1.0分.根據(jù)得分可知，在25 μL反應(yīng)體系中，當(dāng)模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L－1、Mg2 +2.25 mmol·L－1、引物0.48 μmol·L－1、Taq DNA聚合酶0.75 U時，實現(xiàn)最佳擴(kuò)增，確定為最優(yōu)組合.以來自海南三亞、廣東興寧、廣西梧州、福建建甌、江西南昌、安徽利辛、陜西蒲城、河北邯鄲的8個苦楝種源DNA為模板，選取引物Me27/Em2、Me27/Em4進(jìn)行SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗證，結(jié)果表明，篩選體系能很好地滿足苦楝基因組SRAP-PCR擴(kuò)增的要求且不同種源間條帶有差異.

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Establishment and optimization of SRAP-PCR system in Melia azedarach

CHEN Lijun1，2，LIU Mingqian1，LIAO Boyong1，DENG Xiaomei1，CHEN Xiaoyang1
(1 Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm/College of Forestry，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2 Center for Teaching and Research Base，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】In order to study the genetic diversity and evaluate the germplasm resources of Melia azedarach using SRAP markers，the concentration of DNA template，dNTPs，Mg2 +，primer and Taq polymerase were tested to determine their optimal levels and establish the optimal SRAP reaction system in M.azedarach.【Method】Five factors，each with 8 concentration levels，were conducted to screen their feasible concentration range using single factor experiment，and then the orthogonal experiment L16(45) was carried out and the optimized system was determined.【Result and conclusion】The concentration range of DNA template was wider in SRAP system in M.azedarach.When the concentration of dNTPs ranged from 0.1 to 0.2 mmol·L－1，the bands were steady; when the concentration of Mg2 +was around 2.0 mmol·L－1，more bands were amplified and clear.The band type was consistent and clear when the primer concentration ranged from 0.48 to 0.64 μmol·L－1.When the Taq polymerase ranged from 0.50 to 2.00 U，more bands were amplified and clear.The optimum SRAP-PCR system was established on the basis of orthogonal experiment，which was DNA template 30 ng，dNTPs 0.125 mmol·L－1，Mg2 +2.25 mmol·L－1，primers 0.48 μmol·L－1，and Taq DNA polymerase 0.75 U in the 25 μL reaction system.

基金項目:廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2011KJCX002)

作者簡介:陳麗君(1989—)，女，碩士，E-mail: chenlijun0311@ 163.com;通信作者:陳曉陽(1958—)，男，教授，博士，E-mail: xychen@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-01-27

文章編號:1001-411X(2015) 03-0104-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S792.33