自由基清除劑對(duì)癲癇大鼠海馬組織Fyn的亞硝基化影響

袁玉玶，郝凌云，魏學(xué)文

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自由基清除劑對(duì)癲癇大鼠海馬組織Fyn的亞硝基化影響

袁玉玶1，郝凌云2，魏學(xué)文1

目的研究自由基清除劑對(duì)癲癇大鼠海馬組織Fyn的亞硝基化影響，并探討其變化的可能機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為癲癇對(duì)照組(saline組)、癲癇組(KA組)和藥物對(duì)照組(KA+saline組)及MCI-186組(KA+MCI-186組)。采用腦室注射海人酸制作大鼠癲癇模型。海馬組織勻漿，取蛋白樣品用抗Fyn抗體作免疫沉淀，然后用抗-SNO-Cys抗體做免疫印跡，檢測(cè)Fyn巰基亞硝基化。結(jié)果Fyn的亞硝基化水平癲癇組和藥物對(duì)照組增加(P<0.05)，MCI-186組較藥物對(duì)照組降低(P<0.05)，F(xiàn)yn的蛋白表達(dá)各組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論自由基清除劑可能通過(guò)抑制癲癇誘導(dǎo)海馬組織Fyn的巰基亞硝基化，調(diào)節(jié)NMDA受體NR2B亞基磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)NMDA受體通道功能，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。

自由基清除劑；癲癇；Fyn；亞硝基化

酪氨酸蛋白激酶Fyn是非受體酪氨酸激酶Src家族(Src、Fyn、Yes、Lck和Lyn等)中的一員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Fyn與眾多生理活動(dòng)密切相關(guān)，參與多種神經(jīng)元信號(hào)通路和谷氨酸興奮毒性等神經(jīng)病理過(guò)程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[1]。一氧化氮(nitric oxide，NO)一方面通過(guò)NO/cGMP途徑，即NO誘導(dǎo)cGMP的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)蛋白激酶G的活性，影響生物體的活動(dòng)；另一方面，NO還可以共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)的半胱氨酸側(cè)鏈上，通過(guò)亞硝基化作用即蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾對(duì)生物大分子的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)的亞硝基化是一種與蛋白質(zhì)磷酸化相似的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要方式，對(duì)蛋白質(zhì)功能有重要作用的翻譯后修飾[2]。我們的離體和在體實(shí)驗(yàn)[3,4]顯示Fyn存在著巰基亞硝基化修飾。 癲癇是以神經(jīng)元興奮和抑制失衡引起的過(guò)度興奮導(dǎo)致神經(jīng)元群同步異常放電為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，被WHO定義為神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的神經(jīng)功能障礙。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸興奮性毒性、鈣超載等多種因素都能誘導(dǎo)神經(jīng)元異常放電而引發(fā)癲癇。在發(fā)作過(guò)程中，三者之間密切相關(guān)，其中氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)[5]。因此，抑制氧化應(yīng)激和清除氧自由基可成為治療癲癇的重要策略[6]。

本實(shí)驗(yàn)用海人酸(kainic acid，KA)制作大鼠癲癇模型，觀察大鼠癲癇誘導(dǎo)的海馬組織Fyn的巰基亞硝基化水平變化及自由基清除劑MCI-186對(duì)其亞硝基化的影響，并探討其變化的可能機(jī)制，為臨床癲癇發(fā)病機(jī)制研究和使用自由基清除劑治療癲癇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，SPF級(jí)，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2007-0005，使用許可證：SYXK(蘇)2007-0037]。抗Fyn(15) (sc-434)抗體，actin(H-300) (sc-10731)抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。Rabbit polyclonal Anti-SNO-Cys(N5411)，anti-rabbit IgG(T6778)抗體為Sigma-Aldrich，Inc.公司產(chǎn)品。KA為Biomol公司產(chǎn)品。MCI-186為國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司生產(chǎn) 。

1.2腦室注射KA誘導(dǎo)癲癇將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：癲癇對(duì)照組，腦室內(nèi)注射生理鹽水； 癲癇組，腦室內(nèi)注射KA；藥物對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水，腦室內(nèi)注射KA；MCI-186組，腹腔內(nèi)注射MCI-186，腦室內(nèi)注射KA。SD大鼠用乙醚麻醉，定位左側(cè)腦室：前囟后開(kāi)0.8 mm，旁開(kāi)1.5 mm，顱骨表面向下3.5 mm。KA溶于滅菌生理鹽水中，濃度為60 μg/ml，注射體積為10 L，10 min內(nèi)注射完成，注射針滯留5 min，以1 mm/min速度取出。癲癇對(duì)照組注射相同體積的滅菌生理鹽水。大鼠癲癇按Racine分級(jí)法分為5級(jí)[7]。前驅(qū)癥狀：凝視、點(diǎn)頭和濕狗樣抖動(dòng)。1 級(jí)：面部肌肉痙攣表現(xiàn)為咀嚼運(yùn)動(dòng)；2 級(jí)：頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；3 級(jí)：一側(cè)前肢陣攣；4級(jí)：站立伴雙前肢陣攣；5級(jí)：在4級(jí)的基礎(chǔ)上身體向后倒下。選取4-5級(jí)，EEG示癇樣放電者供研究使用，每組4只。

1.3給藥方式MCI-186以8.0 mg/kg的劑量于KA注射前40 min腹腔注射給藥，藥物對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水。

1.4樣品制備KA注射6 h取海馬組織勻漿：KA 注射6 h，大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后快速斷頭取腦，分離海馬組織，置液氮中凍存?zhèn)溆?。以下操作均在冰水浴中進(jìn)行：從液氮中取出海馬組織加入勻漿緩沖液，用Glas-col勻漿器高速勻漿(10 s×10次)，勻漿液用低溫離心機(jī)，4 ℃ 1000 g 離心15 min，取上清液，測(cè)蛋白后分裝，置-80 ℃冰箱待用。

1.5Fyn巰基亞硝基化的測(cè)定取蛋白樣品200 μg，加入2 μg抗Fyn抗體作免疫沉淀，然后用抗-SNO-Cys抗體做免疫印跡。以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應(yīng)，結(jié)果掃描后以Image J分析軟件進(jìn)行分析處理。各條帶的O.D以同一張膜上癲癇對(duì)照組(saline組)倍數(shù)表示。

2　結(jié)　果

KA 可以誘導(dǎo)癲癇大鼠海馬組織Fyn的亞硝基化，自由基清除劑MCI-186能夠抑制Fyn的巰基亞硝基化。Fyn的亞硝基化水平癲癇組和藥物對(duì)照組增加(P<0.05)，MCI-186組較藥物對(duì)照組降低(P<0.05)，F(xiàn)yn 的蛋白表達(dá)各組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3　討　論

Fyn為細(xì)胞內(nèi)非受體型酪氨酸激酶，是Src家族蛋白酪氨酸激酶中的一員，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達(dá)[8]，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)顯示大鼠癲癇可以誘導(dǎo)其海馬組織Fyn的巰基亞硝基化，自由基清除劑MCI-186能夠抑制癲癇導(dǎo)致的Fyn的亞硝基化水平增高。

蛋白質(zhì)的巰基亞硝基化(S-nitrosylation，SNO)，是通過(guò)一氧化氮共價(jià)偶聯(lián)修飾半胱氨酸側(cè)鏈的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。生物體內(nèi)的NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸生成。NOS是一氧化氮合成過(guò)程中的重要限速酶，它分為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。體內(nèi)一氧化氮的作用完全依賴于一氧化氮合酶的活性。在腦中存在的一氧化氮合酶主要是nNOS和iNOS。nNOS主要在神經(jīng)元表達(dá)，具有鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性，主要介導(dǎo)神經(jīng)元早期損傷；iNOS不依賴鈣離子/鈣調(diào)素，由炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)，引起神經(jīng)元后期的損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)癲癇后30 min NO水平開(kāi)始升高，且可維持增高7 d，其峰值在發(fā)作后6 h和72 h，此與nNOS活化時(shí)間相一致[9]，因此，我們選擇癲癇發(fā)作后6 h時(shí)間點(diǎn)來(lái)研究Fyn亞硝基化。

在腦中高度表達(dá)的Fyn，參與中樞系統(tǒng)疾病相關(guān)的信號(hào)通路。通過(guò)其自身SH2、SH3結(jié)構(gòu)域與其它分子結(jié)合(如Fyn能與PSD95形成復(fù)合物)發(fā)揮功能。NR2B作為N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體的一個(gè)重要調(diào)節(jié)亞基，是NMDA受體行使其正常功能(如神經(jīng)元的存活、突觸可塑性等)不可或缺的，F(xiàn)yn可直接磷酸化NR2B而調(diào)節(jié)NMDA受體功能[10]。

NMDA受體是興奮性氨基酸谷氨酸的特異性受體，是大腦中最重要的受體之一[11]，由NRl亞基和NR2亞基(NR2A-NR2D)組成，在癲癇發(fā)作的病理生理中起著至關(guān)重要的作用。癲癇時(shí)NMDA受體被激活后，離子通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流，促使鈣-鈣調(diào)素復(fù)合物形成，依賴于Ca2+或鈣調(diào)蛋白的nNOS活性增強(qiáng)，引起NO合成增多。NO與可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)結(jié)構(gòu)中的Fe2+結(jié)合，使sGC發(fā)生構(gòu)象改變而被激活，通過(guò)激活的NMDAR/NO/cGMP生化通路，增多的cGMP改變離子通道活性，促使谷氨酸進(jìn)一步釋放，抑制谷氨酸再攝取，正反饋調(diào)節(jié)NMDA受體活性，同時(shí)激活cADP核糖化酶，加劇Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致惡性循環(huán)，引起細(xì)胞去極化產(chǎn)生異常放電，導(dǎo)致癇性發(fā)作的產(chǎn)生、傳播[12]。同時(shí)，谷氨酸過(guò)度釋放，活化NMDA受體，使Ca2+內(nèi)流，可激活細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶及nNOS，產(chǎn)生自由基，損傷細(xì)胞膜、結(jié)構(gòu)蛋白及必需酶；并可誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)因子的活化，如p53，死亡促進(jìn)因子bcl-2家族，caspase家族，核酸內(nèi)切酶等，促進(jìn)DNA的裂解，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]。另外，NO與許多蛋白質(zhì)(包括Fyn)發(fā)生亞硝基化參與細(xì)胞凋亡。神經(jīng)元凋亡即是癲癇發(fā)作的結(jié)果，又是癲癇發(fā)生的原因。在細(xì)胞凋亡通路中，NMDA受體介導(dǎo)的興奮性氨基酸毒性至關(guān)重要，起到啟動(dòng)者和執(zhí)行者的作用。因此，調(diào)節(jié)NMDA受體功能是癲癇治療的重要策略。研究表明，自由基既是癲癇發(fā)作時(shí)腦內(nèi)異常代謝的產(chǎn)物，同時(shí)又參與了癲癇的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)一步加重了癲癇時(shí)的腦損傷?？寡趸瘬p傷、有效清除自由基逐漸成為人們治療癲癇、減輕癲癇致神經(jīng)元損傷的又一探索途徑[14]。癲癇導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Fyn的活化及其下游靶點(diǎn)的磷酸化[15]。MCI-186是一種新型自由基清除劑，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，已有研究證實(shí)它可以減少內(nèi)源性NO的產(chǎn)生[16]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示海馬組織Fyn的亞硝基化水平癲癇組和藥物對(duì)照組明顯增加，MCI-186組較藥物對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明癲癇可以誘導(dǎo)大鼠海馬組織Fyn的亞硝基化，自由基清除劑能夠抑制Fyn的巰基亞硝基化。推測(cè)其可能機(jī)制為自由基清除劑減少內(nèi)源性NO的產(chǎn)生，或逆轉(zhuǎn)了CyS-SNO的效應(yīng)。這還有待進(jìn)一步的探討。蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾可通過(guò)影響蛋白質(zhì)活性、蛋白質(zhì)表達(dá)、亞細(xì)胞定位、分子間相互作用對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行調(diào)控。癲癇導(dǎo)致的內(nèi)源性NO，通過(guò)巰基亞硝基化修飾可以直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)Fyn功能，也可通過(guò)形成二硫鍵等與NO相關(guān)的巰基氧化修飾間接調(diào)節(jié)其功能。NR2B是NMDA受體的主要調(diào)節(jié)亞基，我們推測(cè)自由基清除劑可能通過(guò)抑制癲癇誘導(dǎo)海馬組織Fyn的巰基亞硝基化，減少活化，從而調(diào)節(jié)NMDA受體NR2B亞基磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)NMDA受體通道功能，阻斷其凋亡通路，起到神經(jīng)保護(hù)作用。此可為癲癇發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新的思路。

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The effect of free radical scavenger on the S-nitrosylation of Fyn in hippocampus of epileptic rats

YUANYuping,HAOLingyun,WEIXuewen.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstPeople’sHospitalofXuzhou,Xuzhou221002,China)

ObjectiveTo investigate whether tyrosine protein kinase Fyn can be S-nitrosylated and the effect of free radical scavenger on the S-nitrosylation of Fyn in kainic acid-induced epileptic rats and to elucidate its possible mechanism.MethodsAdult male SD rats were allotted into 4 groups as following:control group (saline),seizure group (KA),drug control group (KA+saline) and MCI-186 group (MCI-186+KA).Seizures were induced by intra-cerebroventricular injection of KA dissolved in sterile saline.MCI-186 was intraperitoneally administrated to the rats 40 min before KA injection.Measurement of S-nitrosylated Fyn was performed by immunoprecipitation with anti-Fyn antibody,followed by immunoblotting with anti-SNO-Cys antibody.ResultsCompared with saline group,the level of the S-nitrosylated Fyn increased significantly in KA group and KA+saline group (P<0.05).Compared with KA group and KA+saline group,the S-nitrosylation of Fyn decreased significantly in MCI-186+KA group (P<0.05).In contrast,the protein expression showed no obvious alteration (P>0.05).ConclusionFree radical scavenger may involve in inhibiting the S-nitrosylation of Fyn,which suppressed the interactions of Fyn with NR2B and NR2B tyrosine phosphorylation and subsequently downregulated NMDA receptor overactivation,thus protected neurons from epileptic injury.

Free radical scavenger;Seizure;Fyn;S-nitrosylation

1003-2754(2016)04-0327-03

2015-12-28；

2016-03-29

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(No.JLY20140126)

(1.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221002)

魏學(xué)文，E-mail：xw-xz@sohu.com

R742.1

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