川芎嗪對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

來(lái)岳標(biāo)汪玉琪姚慶華

·論著·

川芎嗪對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

來(lái)岳標(biāo)1汪玉琪1姚慶華2

目的 觀察川芎嗪（TMP）對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞株凋亡的影響及其可能的機(jī)制。方法建立乳腺癌MCF7細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。MTT法檢測(cè)不同濃度TMP對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀、電子顯微鏡和免疫印跡法分別檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡比例，觀察細(xì)胞凋亡特征，檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因如ERK、p38和JNK表達(dá)水平。結(jié)果予0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL TMP處理48h后，MCF7細(xì)胞抑制率分別為（2.95±2.45）%、（18.62±4.60）%、（31.15±3.58）%、（47.13± 4.15）%和（62.14±5.23）%；0、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL的TMP處理48h， MCF7細(xì)胞凋亡率分別為1.58%、3.29%、13.21%、19.23%、29.38%，形態(tài)學(xué)觀察顯示典型的凋亡特征。TMP處理后細(xì)胞中p-p38和p-JNK蛋白表達(dá)以劑量依賴的方式增加，而p-ERK以劑量依賴的方式減少。結(jié)論 TMP能誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

乳腺癌；MCF7；凋亡；川芎嗪；MAPK

與其他大多數(shù)國(guó)家一樣，乳腺癌已成為中國(guó)女性最常見的癌癥。中國(guó)乳腺癌每年新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。TMP是從中藥川芎中提取的生物堿，它具有多種生物學(xué)活性。臨床上常用于治療腦血管疾病及腎臟病等[2]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究證明，TMP可以應(yīng)用于抗腫瘤的治療[3-5]。但是TMP發(fā)揮其抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不完全清楚。以往的研究[6]表明，TMP可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在生理和病理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡是一種代謝的過(guò)程，具有特定的形態(tài)特征，包括細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，凋亡小體的形成[7-8]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由不同的細(xì)胞外刺激激活，導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥。已經(jīng)確定細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38和應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）/c－Jun（JNK）是三個(gè)主要的MAPK途徑[9－11]。然而，TMP對(duì)于MCF7細(xì)胞分子水平的作用仍然知道的很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀、電子顯微鏡和免疫印跡法檢測(cè)TMP作用后乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡水平以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討TMP體外誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制，為TMP的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF7細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，用0．25%胰酶常規(guī)消化，1:3～1:5比率進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥 物 注射用鹽酸川芎嗪（商品名：瑞科林，北京四環(huán)科寶制藥有限公司，規(guī)格：80mg/支）。

1.3 試劑及儀器 抗體包括Action，ERK，p38，JNK，P－ERK，P－P38，P－JNK，均從Sigma購(gòu)買（圣路易斯，美國(guó)）。U0126（ERK抑制劑），SB203580（p38抑制劑）及SP600125（JNK抑制劑）從Sigma購(gòu)買（圣路易斯，美國(guó)）。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒從碧云天公司購(gòu)買（上海，中國(guó)）。透射電鏡由浙江大學(xué)提供（浙江，中國(guó)），流式細(xì)胞儀及本研究所需的其余儀器設(shè)備由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院提供（浙江，中國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTT法檢測(cè)TMP對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至4×104個(gè)/mL，然后將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔200μL。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，各實(shí)驗(yàn)組分別加入含0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL的 TMP空白血清DMEM 200μL。每個(gè)藥物濃度設(shè)置五個(gè)平行孔。在作用24、48、72h后分別加入20μL的MTT液，然后再培養(yǎng)4h后仔細(xì)吸除上清；每孔均勻加入150μL二甲基亞砜。用多模式微孔板閱讀機(jī)器測(cè)定吸光度（A），檢測(cè)參考波長(zhǎng)為570、630nm，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 PI單染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMP對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞周期的作用 MCF7細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，分對(duì)照組及0．50mg/mL、1．00mg/mL、1．50mg/mL、2．00mg/mL濃度TMP干預(yù)組。藥物作用48h后用0．25%的胰酶消化，收集細(xì)胞。制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。取1mL細(xì)胞，1000rpm 4℃離心10min，棄上清液。各管中加入195μL Annexin－Ⅴ－FITC結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin－Ⅴ－FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育 10min。1000rpm離心5min，棄上清。各流式管中加入195μL結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細(xì)胞。加入5μLPI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置10min。流式細(xì)胞儀上測(cè)定，數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)處理并打印。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 MCF7細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24h后小心吸棄培養(yǎng)上清液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和TMP干預(yù)組，其中TMP干預(yù)組加入含1．00mg/mL TMP血清培養(yǎng)液3mL，而對(duì)照組僅加等量的空白血清培養(yǎng)液，各自培養(yǎng)48h后小心吸棄培養(yǎng)上清液。取對(duì)照組及1．00mg/mL TMP干預(yù)滿48h的MCF7細(xì)胞，用0．25%的胰酶消化，離心收集細(xì)胞。用2．5%的戊二醛固定2h，1%鋨酸再固定30min，乙醇一丙酮梯度脫水，包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡下觀察。

1.4.4 免疫蛋白印跡分析 不同濃度TMP處理的MCF7細(xì)胞樣品在RIPA裂解緩沖液勻漿。蛋白濃度用BCA法檢測(cè)。印跡膜封閉于5%牛血清白蛋白，隨后分別暴露于特定的一抗：ERK（1:2000），p38（1: 2000），JNK（1:2000），p－ERK（1:2000），p－p38（1: 2000），p－JNK（1:2000）。用HRP標(biāo)記的第二抗體孵育后，電化學(xué)發(fā)光試劑處理膜，然后暴露于放射自顯影儀中進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 TMP對(duì)MCF7細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的TMP作用MCF7細(xì)胞24～72h后，MTT比色法測(cè)得的各組細(xì)胞抑制率顯示示，TMP能明顯抑制MCF7細(xì)胞的增殖，TMP 0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL處理48h，對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為（2．95± 2．45）%、（18．62±4．60）%、（31．15±3．58）%、（47．13± 4．15）%和（62．14±5．23）%，作用呈劑量和時(shí)間依賴性。見圖1（202頁(yè)）。

2.2 細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMP對(duì)MCF的凋亡作用 0、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL TMP處理細(xì)胞48h后，AV+/PI－的數(shù)量（細(xì)胞凋亡）分別為1．58%、3．29%、13．21%、19．23%、29．38%，呈現(xiàn)出濃度依賴性，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)果表明，TMP可誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡。見圖2（202頁(yè)）。

2.3 TMP作用前后MCF7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變 正常情況下MCF7細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)良好，形狀不規(guī)則，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生長(zhǎng)有巢狀現(xiàn)象，細(xì)胞核大，核異型，核質(zhì)比高，可見異常核分裂相。TMP作用前后透射電鏡，結(jié)果顯示，對(duì)照組MCF7細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器清晰,見圖3A（封三）。1．0mg/mL TMP作用48h后，MCF7細(xì)胞發(fā)生了凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征性變化，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)密集，胞漿濃縮，胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的空泡，見圖3B（封三）。

2.4 MAPK信號(hào)通路在TMP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用 為探討MAPK信號(hào)通路是否參與了TMP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，檢測(cè)MAPK信號(hào)通路的磷酸化水平。1、2mg/mL的TMP處理細(xì)胞48h后，用Western blot檢測(cè)ERK、p38和JNK的表達(dá)。TMP處理MCF7細(xì)胞后磷酸化ERK的表達(dá)量持續(xù)降低，磷酸化p38和磷酸化JNK表達(dá)增加；而JNK和p38和ERK的總量變化不大，見圖4（封三）。這些結(jié)果表明，TMP減少了ERK的活化，促進(jìn)p38、JNK的活化，而這些變化是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的。為確定是否這些激酶可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞MAPK的活化，用MAPK通路抑制劑U0126、SB203580和SP600125分別處理MCF7細(xì)胞1h后加入1mg/mL TMP處理48h。我們發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑U0126處理1h后ERK的磷酸化水平增加明顯，而p38抑制劑SB203580處理細(xì)胞1h后p38的磷酸化水平降低。同樣，JNK的磷酸化也在細(xì)胞運(yùn)用SP600125處理后降低，見圖5（202頁(yè)）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種基因編碼的導(dǎo)致細(xì)胞開啟自殺程序的結(jié)果，具有形態(tài)和生化變化，可見染色質(zhì)邊集，核碎片的產(chǎn)生。本研究中，TMP誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡呈劑量和時(shí)間依賴性，已由流式檢測(cè)中PI 和Annexin V的變化說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)電子顯微鏡觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，直接證明MCF7細(xì)胞的凋亡。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，1mg/mL的TMP處理后細(xì)胞微絨毛消失，細(xì)胞收縮，核碎片含有的染色質(zhì)濃縮和膜泡，細(xì)胞質(zhì)邊集，呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)的變化。

MAPK信號(hào)通路在多種細(xì)胞外信號(hào)刺激細(xì)胞表面激活細(xì)胞核內(nèi)的基因并作出相應(yīng)的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。通常是由有絲分裂原刺激的ERK參與細(xì)胞的增殖、分化和增殖活性。JNK和p38激酶主要由細(xì)胞外刺激產(chǎn)生應(yīng)答。這些激酶的激活導(dǎo)致細(xì)胞的反應(yīng)取決于細(xì)胞類型的變量。一些研究表明，雙重作用的細(xì)胞反應(yīng)中的MAPK似乎是特定類型的細(xì)胞凋亡[12－14]。MAPK活性在細(xì)胞凋亡中的確切作用仍有待進(jìn)一步研究[15－19]。該研究發(fā)現(xiàn)，TMP處理24h后，磷酸化JNK和磷酸化p38含量有明顯的劑量依賴性增加，但磷酸化ERK有一個(gè)明顯的降低，且呈劑量依賴性。研究結(jié)果表明，TMP處理后的p38、JNK 和ERK均有明顯的變化，而MAPK通路川芎嗪誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞的凋亡中扮演著重要的角色。

綜上所述，本研究表明TMP處理后能引起乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡，同時(shí)TMP可以使p38、JNK活化，表明MAPK通路在TMP誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。

［1］Fan L，Rasser-Weippl K，Li JJ，et al.Breast cancer in China ［J］．Lancet Oncol，2014，15（7）：e279－e289．

［2］李家邦.中醫(yī)學(xué)［M］.第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：177－178．

［3］李建華，楊佩滿.川芎嗪逆轉(zhuǎn)K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥性的研究［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，10（8）：1405－1407．

［4］劉志良，崔倫伯.川芎嗪對(duì)小鼠小細(xì)胞肺癌血管生長(zhǎng)和VEGF表達(dá)的抑制［J］．遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（1）：13－16．

［5］張會(huì)軍，閻蘊(yùn)力，張朱欣，等.川芎嗪對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖抑制作用［J］．腫瘤防治研究，2003，30（6）：452－454．

［6］劉寶瑞，徐修禮，劉文超，等.4種中藥制劑對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（10）：94－96．

［7］Fadeel B，Orrenius S.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide－ranging implications in human disease ［J］．J Intern Med，2005，258（6）：479－517．

［8］Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis［J］.Nature，2000，407（6805）：770－776．

［9］Stennicke HR，Deveraux QL，Humke EW，et al.Caspase-9 can be activated without proteolytic processing［J］．Biol Chem，1999，274（13）：8359－8362．

［10］Harada-Shiba M，Kinoshita M，Kamido H，et al.Oxidized low density lipoprotein inducesapoptosis in cultured human umbilical vein endothelial cells by common and unique mechanisms ［J］.Biol Chem，1998，273（16）：9681-9687.

［11］Napoli C，Quehenberger O，De Nigris F，et al.Mildly oxidized low density lipoprotein activates multiple apoptotic signaling pathways in human coronary cells［J］.FASEB，2000，14（13）：1996-2007.

［12］Kyriakis JM，Avruch J.Mammalian mitogen-activated proteinkinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation［J］.Physiol Rev，2001，81（2）：807-869.

［13］Chung HS，Park SR，Choi EK，et al.Role of sphingomyelin-MAPKs pathway in heatinduced apoptosis［J］.Exp Mol Med，2003，35（3）：181-188.

［14］Kang SH，Song JH，Kang HK，et al.Arsenic trioxide-induced apoptosis is independent of stress-responsive signaling pathways but sensitive to inhibition of inducible nitric oxide synthase in HepG2 cells［J］.Exp Mol Med，2003，35（2）：83-90.

［15］Chen YC，Tsai SH，Shen SC，et al.Alternative activation of extracellular signal-regulated protein kinases in curcumin and arsenite-induced HSP70 gene expression in human colorectal carcinoma cells［J］.Eur J Cell Biol，2001，80 （3）：213-221.

［16］Aoki H，Takada Y，Kondo S，et al.Evidence that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo through induction of autophagy：role of Akt and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways［J］.Mol Pharmacol，2007，72（1）：29-39.

［17］Collett GP，Campbell FC.Curcumin induces c-jun N-terminal kinase-dependent apoptosis in HCT116 human colon cancer cells［J］.Carcinogenesis，2004，25（11）：2183-2189.

［18］ Woo MS，Jung SH，Kim SY，et al.Curcumin suppresses phorbol ester-induced matrix metalloproteinase-9 expression by inhibiting the PKC to MAPK signaling pathways in human astroglioma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，335（4）：1017-1025.

［19］Choi BH，Kim CG，Bae YS，et al.p21 Waf1/Cip1 expression by curcumin in U-87MG human glioma cells：role of early growth response-1 expression［J］.Cancer Res，2008，68（5）：1369-1377.

（收稿：2015-07-08 修回：2015-09-28）

Effectof Tetramethypyrazine on Breast Cancer MCF7 CellApoptosis and The Underlying Mechanism

LAIYuebiao1,WANG Yuqi1,YAO Qinghua2.1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China;2 Department of Integrated Chinese and Western Medicine,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou（310022）,China

ObjectiveTo study the effectof tetramethypyrazine on breast cancer MCF7 Cellapoptosis and the underlying mechanism.MethodsHuman breast cancer MCF7 cellscultured in vitrowere used to detect the inhibition rate of tetramethypyrazine in different concentrations（0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml）by MTT assay.The flow cytometry,electron microscope and western blot method were used to detect the apoptosis ratioofdifferent groups;the apoptosis characteristics were observed;andthe level of MAPK signal pathway related genes ERK, p38and JNK,were determined.ResultsAfter treatment with tetramethypyrazine for 48h,the inhibition rate of human breast cancer MCF7 cells in 0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml groups were（2.95±2.45）%,（18.62±4.60）%, （31.15±3.58）%,（47.13±4.15）%,and（62.14±5.23）%,respectively;the apoptosis ratio of MCF7 cells were1.58%, 3.29%,13.21%,19.23%,and 29.38%.Morphological observation showed typical apoptosis characteristics of MCF7 cells after tetramethypyrazine treatment.The protein expression of p-p38and p-JNK increased in a dose-dependent manner,but p-ERK reduced.ConclusionTetramethypyrazinecan induce the apoptosis of breast cancer MCF7 cells,and its mechanism may be related to activation of MAPK signal pathway.

apoptosis;MCF7;apoptosis;tetramethypyrazine;MAPK

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）；2浙江省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科（杭州 310022）

姚慶華，TEL：13588899111；E-mail：danfer1001@163.com