視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關(guān)系的研究

孫昱昭，張若霜，谷　峰

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·實(shí)驗(yàn)論著·

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關(guān)系的研究

孫昱昭，張若霜，谷峰

Study on relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial cells and MERTK-Ras-myosin signal pathway

Citation:Sun YZ, Zhang RS, Gu F. Study on relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial cells and MERTK-Ras-myosin signal pathway.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):28-33

摘要

目的:研究視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞吞噬功能與MERTK受體及其下游信號(hào)通路Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白的關(guān)系。

方法：用視細(xì)胞外節(jié)膜盤(rod outer segments，ROS)于37℃孵育離體培養(yǎng)的3～5代C57小鼠RPE細(xì)胞，在孵育0、30、60、120、180、240min終止吞噬反應(yīng)。雙重?zé)晒鈽?biāo)記法檢測(cè)RPE細(xì)胞吞噬動(dòng)力學(xué)；以MERTK及Ras抗體、磷酸化MEK及MLCK抗體應(yīng)用Western-Blot方法檢測(cè)不同孵育時(shí)間(30、60、120、180min)MERTK、Ras、MEK及MLCK的激活狀態(tài)；以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒方法抑制Ras及MERTK基因表達(dá)后，再次以Western-Blot方法檢測(cè)對(duì)應(yīng)時(shí)間MERTK-Ras通路激活狀態(tài)及吞噬功能的變化。

結(jié)果：C57小鼠RPE細(xì)胞吞入ROS發(fā)生在孵育30min，并在3h達(dá)到飽和。在吞噬過程中，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表達(dá)水平不斷增多(與對(duì)照組相比，P<0.05)。Ras及MERTK干擾后的RPE細(xì)胞與ROS共孵育(30、60、120、180min)的全過程中，MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表達(dá)及ROS的吞入數(shù)量始終維持較低水平，僅在孵育180min見到少量ROS吞入；與未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞相比，siRas-RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS共孵育120、180min時(shí)，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)量均明顯減少(P<0.05)。

結(jié)論：Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白通路是鼠RPE細(xì)胞吞噬過程中MERTK受體激活的下游信號(hào)通路。

關(guān)鍵詞：視網(wǎng)膜色素上皮；吞噬；MERTK；Ras；肌球蛋白

引用：孫昱昭，張若霜，谷峰.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬功能與MERTK-Ras-肌球蛋白通路關(guān)系的研究.國(guó)際眼科雜志2016;16(1):28-33

0引言

研究表明視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞吞噬功能障礙是視網(wǎng)膜色素變性的病因，但目前對(duì)RPE細(xì)胞吞噬功能的確切機(jī)制尚不清楚。以往對(duì)RPE細(xì)胞吞噬功能的研究表明，RPE細(xì)胞對(duì)視細(xì)胞外節(jié)膜盤(rod outer segments，ROS)的吞噬是受體介導(dǎo)的特異性吞噬過程，分為結(jié)合、攝入及消化三個(gè)不同的時(shí)相[1]；而MERTK被認(rèn)為是啟動(dòng)RPE細(xì)胞吞噬ROS過程的受體分子[2]，并可與RPE細(xì)胞表面唯一的整合素受體分子αvβ5通過磷酸化黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)發(fā)生“crosstalk”促進(jìn)吞噬[3]。但是，RPE細(xì)胞吞噬過程中MERTK所啟動(dòng)的確切下游信號(hào)目前仍不清楚。已知MERTK介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬激活了蛋白激酶C(PKCβⅡ)，并通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白(actin)的分布形成吞噬杯來吞噬凋亡的細(xì)胞[4]；然而RPE細(xì)胞吞噬ROS的過程中MERTK并不直接作用于actin，而是通過靶向作用于非肌性肌球蛋白myosinⅡ來形成吞噬杯以完成對(duì)ROS的吞入過程的[5]。但是MERTK通過哪種信號(hào)通路來靶向作用于肌球蛋白myosin，目前尚未見明確報(bào)道。

MERTK受體是一種受體酪氨酸激酶[6]，具有受體和激酶的雙重功能，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。與MERTK相關(guān)的信號(hào)通路比較復(fù)雜，目前已知的Ras-MAPK途徑是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及整合素等所共有的信號(hào)通路[7]。有研究表明，尿激酶-血纖維蛋白溶酶原激活物(U-PA)可以通過選擇性地整合素受體分子αvβ5，經(jīng)由Ras-MEK(extracellular signal regulated kinase kinase，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的激酶)-ERK(extracellular signal regulated kinase，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)-MLCK(myosin light chain kinase，肌球蛋白輕鏈激酶)通路激活myosin來刺激細(xì)胞的遷移[8]。也有研究表明，抗高血壓藥物卡托普利也通過Ras-MEK-MLCK通路作用于腸系膜動(dòng)脈的myosin來降低血壓[9]，這提示我們，RPE細(xì)胞吞噬過程中MERTK受體后通路可能涉及Ras-MEK-MLCK-myosin途徑。為此，本研究擬探討RPE細(xì)胞是否通過MERTK受體介導(dǎo)的Ras-MEK-MLCK信號(hào)通路來發(fā)揮吞噬ROS的功能，為RPE細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控及臨床治療視網(wǎng)膜色素變性提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，7～10周齡，體質(zhì)量20～22g，購自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級(jí)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房(恒溫：25℃；濕度：40%～50%；光照：8 h/d)。

1.1.2試劑DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液及Hanks液(美國(guó)Gibco公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Difco公司)，胎牛血清(FCS，天津TBD公司)，F(xiàn)luro-3/AM(美國(guó)Sigma公司)，fluorescein isothiocyanate(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC)及sulforhodamine(硫酰羅達(dá)明，SR，美國(guó)Invitrogen-Molecular Probe公司)，蔗糖及Tris(氨丁三醇)(中國(guó)聯(lián)星公司)，SYBR Green Real-Time PCR KIT(TaKaRa公司)，RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，MERTK抗體(德國(guó)Acris antibodies公司)，Ras、MEK、MLCK抗體(Cell signal technology)，限制性內(nèi)切酶(加拿大Fermetas公司)，高純質(zhì)粒制備試劑 (北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，Lipo2000(美國(guó)Invitrogen公司)。Olympus-IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)及Diagnostic instruments-spot insigh熒光數(shù)字圖象采集攝像系統(tǒng)(美國(guó)DI公司)。Exicycler 96熒光定量PCR儀(韓國(guó)BIONEER)。凝膠成像分析儀(北京六一WD-9413B)。雙垂直蛋白電泳儀(北京六一DYCZ-24DN)。

1.2方法

1.2.1 RPE細(xì)胞培養(yǎng)采用胰蛋白酶消化法[2]，每次取4只C57BL/6鼠，麻醉后剜除眼球，剪除角膜、去除晶狀體后將眼杯置于0.2%胰酶中消化50min，吹打、離心收集后以含有20%小牛血清、1%青鏈霉素及1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酸的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，融合后傳代。第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用Cytokeratin-8進(jìn)行RPE細(xì)胞鑒定，Cytokeratin-8免疫染色陽性細(xì)胞為RPE細(xì)胞。

1.2.2 ROS提取及染色根據(jù)Papermaster等[10]的方法并有所改動(dòng)提取ROS，簡(jiǎn)言之：將人視網(wǎng)膜神經(jīng)層懸于340g/L蔗糖勻漿液中，劇烈搖動(dòng)1min后，以4 000r/min離心4min，收集上清，并加入二倍于其體積的10mmol/L Tris-HCl緩沖液，然后以4 000r/min離心4min，收集沉淀，加入不連續(xù)密度梯度液的頂層，27 000r/min離心30min。將提取的ROS中加入終濃度為10mg/L FITC液，室溫下，于暗處孵育1h以標(biāo)記ROS。

1.2.3吞噬檢測(cè)采用雙重?zé)晒鈽?biāo)記法進(jìn)行吞噬動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及計(jì)數(shù)[11]，吞噬動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為0、30、60、120、180、240min。用于吞噬動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的RPE細(xì)胞種植在35mm培養(yǎng)皿上。

1.2.4吞噬過程中MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)測(cè)定采用Western-Blot方法：將RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間后[0min(即為對(duì)照組)、30、60、120、180min]，吸出ROS孵育液，并用4℃ Hanks液沖洗細(xì)胞2次，終止吞噬反應(yīng)，然后加入100μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞、離心獲得抽提蛋白。用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度后，-80℃保存?zhèn)溆谩８鲿r(shí)間點(diǎn)蛋白樣品量為60μg。制備5%濃縮膠及濃度為8%、10%、13%的分離膠。加入上樣液20μL及5μL蛋白Marker，電壓80V，恒壓電泳2.5h。以電壓70V轉(zhuǎn)印1.5h將凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜放入5% TBS+脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1h。分別加入稀釋的MERTK抗體(1∶250)、Ras抗體及磷酸化MEK、MLCK抗體(1∶500)4℃孵育過夜，洗脫后加入1∶5000稀釋的二抗37℃孵育45min，再次洗脫，ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參，用Gel-Pro Analyzer圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值)，明確MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)。

1.2.5 Ras及MERTK干擾及干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)測(cè)定構(gòu)建高純度質(zhì)粒后行細(xì)胞轉(zhuǎn)染以干擾Ras/MERTK基因表達(dá)。

圖1RPE細(xì)胞形態(tài)及鑒定A：原代RPE細(xì)胞的融合圖像(倒置顯微鏡，×100)；B：3～5代RPE細(xì)胞的80%

融合圖像(倒置顯微鏡，×100)；C：細(xì)胞RPE細(xì)胞均表現(xiàn)為Cytokeratin-8免疫染色陽性(倒置熒光顯微鏡，×400)。

1.2.5.1質(zhì)粒構(gòu)建分別設(shè)計(jì)3個(gè)干擾片段，位點(diǎn)分別為Ras-245、Ras-509、Ras-601，對(duì)應(yīng)序列分別為245-GAGCGCCTTGACGATACAG，509-GGACTCTGAAGATGTGCCT，601-GGAGTTACGGGATTCCGTT及Mertk-431，Mertk-1316，Mertk-1528，對(duì)應(yīng)序列分別為431-GATGGAAAGGAATTGCTCG，1316-AGCGCAGGGACTTACAAAG， 1528-CACCGACTCTATGTTCATC。對(duì)pRNA-H1.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并與目的基因連接后加入至100μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，鑒定及篩選陽性克隆，標(biāo)記為Ras-sh1，Ras-sh2，Ras-sh3，MERTK-sh1，MERTK-sh2，MERTK-sh3，測(cè)序。

1.2.5.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染配制轉(zhuǎn)染試劑：溶液1：100μL優(yōu)化液+8μL脂質(zhì)體2000；溶液2：100μL優(yōu)化液+2μg質(zhì)粒，將溶液1與溶液2混勻，室溫下放置20min后緩慢加入RPE細(xì)胞培養(yǎng)板中，搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻，37℃、5% CO2培養(yǎng)6h。棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基上清，更換為細(xì)胞完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞以SYBR Green Real-Time PCR KIT檢測(cè)Ras/MERTK基因表達(dá)情況，Ras基因引物分別為：5’-TTGTGGATGAGTATGACCCTA-3’及5’-CTCCTCTTGACCTGCTGTGT-3’，MERTK基因引物分別為：5’-CCTGGCAACACCGACTCTA-3’及5’-TTTACGACCAGTTGGGAATC-3’，內(nèi)參β-actin基因引物分別為5’-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3’及5’-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3’。選擇干擾效果最佳的片段進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.3干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)測(cè)定及吞噬功能檢測(cè)將siRas-RPE細(xì)胞及si-MERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間后[0min(即為對(duì)照組)、30、60、120、180min]采用Western-Blot方法檢測(cè)MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)情況，并比較孵育120min及180min時(shí)未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞、siRas-RPE細(xì)胞及si-MERTK-RPE細(xì)胞中MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)；采用雙重?zé)晒鈽?biāo)記法測(cè)定siRas-RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞的吞噬功能的變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：每步實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以 SPSS 17.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析及單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定原代RPE細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕褐色色素顆粒，細(xì)胞呈多邊形，3～5代RPE細(xì)胞透明，無色素，呈梭形。Cytokeratin-8免疫染色后可見全部RPE細(xì)胞均呈現(xiàn)陽性綠色熒光，提示培養(yǎng)細(xì)胞為RPE細(xì)胞(圖1)。

圖2不同孵育時(shí)間RPE細(xì)胞結(jié)合及吞入ROS數(shù)量。

圖3Western-Blot檢測(cè)RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK表達(dá)的變化A：PVDF膜掃描圖像顯示孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白的表達(dá)；B：孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較。

2.2吞噬檢測(cè)結(jié)果雙重?zé)晒鈽?biāo)記方法檢測(cè)RPE吞噬ROS的結(jié)果顯示，在孵育30min時(shí)可見ROS被RPE吞入胞漿內(nèi)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)結(jié)合及吞入的ROS數(shù)量不斷增加，至孵育3h時(shí)，結(jié)合及吞入的ROS數(shù)量達(dá)到飽和(圖2)。

圖4Ras基因干擾后RPE細(xì)胞Ras基因及蛋白表達(dá)的變化A：Real-time PCR檢測(cè)Ras基因干擾后RPE細(xì)胞Ras基因表達(dá)的變化(以2-△△Ct均值表示)；B：Western-Blot檢測(cè)Ras基因干擾后RPE細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)的變化；C：Real-time PCR檢測(cè)MERTK基因干擾后RPE細(xì)胞MERTK基因表達(dá)的變化(以2-△△Ct均值表示)；D：Western-Blot檢測(cè)MERTK基因干擾后RPE細(xì)胞MERTK蛋白表達(dá)的變化；Control：正常REP細(xì)胞；NC：空載體轉(zhuǎn)染組；siRAS：Ras基因干擾組；siMERTK：MERTK基因干擾組；aP<0.05vsControl組、NC組。

2.3吞噬過程中MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)測(cè)定將3～5代RPE細(xì)胞與ROS共同孵育不同時(shí)間(30、60、120、180min)后，Western-Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示RPE細(xì)胞與ROS共同孵育30min時(shí)，與對(duì)照組(0min)相比，MERTK、MEK和MLCK的磷酸化水平升高，Ras蛋白表達(dá)量增加，并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)MERTK、MEK和MLCK的磷酸化水平與Ras表達(dá)量均不斷增多(P<0.05，圖3)。

2.4 Ras/MERTK干擾及干擾后MERTK-Ras-MEK-MLCK-myosin通路激活狀態(tài)測(cè)定三個(gè)不同片段構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行小鼠RPE細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ras/MERTK后，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Ras-sh3(即Ras-601)及MERTK-sh3(即MERTK-1528)干擾效果最佳。以Ras-sh3及MERTK-sh3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后測(cè)定RPE細(xì)胞Ras及MERTK基因及蛋白表達(dá)均較未轉(zhuǎn)染組明顯降低(P<0.05，圖4)。

以Ras-sh3片段構(gòu)建的質(zhì)粒重新進(jìn)行小鼠RPE細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ras后，將siRNA-Ras的RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間[0min(即為對(duì)照組)、30、60、120、180min]，再次采用Western-Blot方法檢測(cè)MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白的表達(dá)水平均與對(duì)照組(0min)無顯著差異(P>0.05)，即在全部孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達(dá)水平(圖5A第1～5條帶)；同時(shí)，與未轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞相比，siRas-RPE細(xì)胞與ROS共孵育120、180min時(shí)，MERTK、MEK、MLCK的磷酸化水平及Ras蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)(P<0.05，圖5A第6～9條帶)。

以MERTK-sh3片段構(gòu)建的質(zhì)粒重新進(jìn)行小鼠RPE細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ras后，將siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間[0min(即對(duì)照組)、30、60、120、180min]，再次采用Western-Blot方法檢測(cè)MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在全部孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達(dá)水平(P>0.01，圖6第1～5條帶)；同時(shí)，與未轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞相比，siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS共孵育120、180min時(shí)，MERTK及Ras、MEK、MLCK的蛋白表達(dá)量均減少(圖6A第6～9條帶，P<0.05)，但其蛋白表達(dá)的下降幅度并沒有siRas-RPE細(xì)胞大。

siRas-RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞的吞噬數(shù)量的變化：分別將siRas-RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間(30、60、120、180、240min)后，再次進(jìn)行吞噬數(shù)量測(cè)定，結(jié)果顯示siRas-RPE細(xì)胞結(jié)合ROS的數(shù)量隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，而吞入ROS的數(shù)量極少，僅在孵育180min時(shí)可觀察到少量ROS吞入了RPE細(xì)胞內(nèi)。圖6Western-blot檢測(cè)siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化A：Western-Blot檢測(cè)掃描圖像，從左至右:1～5顯示對(duì)照組及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育30、60、120、180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；6、7分別為未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育120min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；8、9分別為未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；β-actin基因?yàn)閮?nèi)參；B：siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化；C:RPE細(xì)胞及siMERTK-RPE細(xì)胞與ROS孵育120min及180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較。

圖5Western-Blot檢測(cè)siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化A：Western-Blot檢測(cè)掃描圖像，從左至右:1～5顯示對(duì)照組及siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育30、60、120、180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；6、7分別為未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞及siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育120min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；8、9分別為未轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞及siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白表達(dá)的變化；β-actin基因?yàn)閮?nèi)參；B：siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育不同時(shí)間MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化；C：RPE細(xì)胞及siRas-RPE細(xì)胞與ROS孵育120min及180min MERTK、Ras、MEK、MLCK蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較。

比較RPE細(xì)胞和siRas-RPE細(xì)胞與ROS結(jié)合與吞入ROS的數(shù)量，可見孵育各時(shí)間點(diǎn)結(jié)合數(shù)量無明顯變化，而吞入ROS的數(shù)量減少了97%(孵育180min時(shí)，圖7)。siMERTK-RPE細(xì)胞結(jié)合ROS的數(shù)量隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，而未見吞入ROS(圖7)。

3討論

與受體酪氨酸激酶(RTK)相關(guān)的信號(hào)通路比較復(fù)雜，目前已知的下游信號(hào)通路分為Ras-MAPK、PI3K-Akt、PLCγ-IP3/DG三種，這三條通路涉及了許多的細(xì)胞功能，如增殖、分化、遷移以及凋亡功能[12-13]，其中的Ras-MAPK途徑是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及整合素等所共有的信號(hào)通路。RTK與腺體結(jié)合后激活，激活的RTK與生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2(Grb2)結(jié)合，Grb2實(shí)際上是一種結(jié)合蛋白，它含有一個(gè)SH2和兩個(gè)SH3域，SH2可與RTK結(jié)合，SH3可與GEF(guanine exchange factor，鳥嘌呤交換因子)結(jié)合，這樣就形成了RTK-Grb2-GEF復(fù)合體，該復(fù)合體在GEF的作用下將Ras激活，進(jìn)而通過逐級(jí)反應(yīng)激活MEK及MLCK，從而活化肌球蛋白myosin，即RTK-Grb2-Ras-MEK-MLCK-myosin通路。近年來的研究證實(shí)，人RPE細(xì)胞吞噬ROS過程中也是通過受體酪氨酸激酶MERTK與細(xì)胞內(nèi)蛋白的SH2域結(jié)合后來啟動(dòng)細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)的[14]。但是RPE細(xì)胞吞噬ROS過程中MERTK磷酸化激活后是否啟動(dòng)了下游的Ras-MEK-MLCK-MLC通路目前尚未見報(bào)道。

圖7不同孵育時(shí)間RPE、siRas-RPE及siMERTK-RPE細(xì)胞及結(jié)合及吞入ROS數(shù)量比較。

本研究在離體條件下模擬RPE細(xì)胞吞噬ROS的條件，并檢測(cè)了吞噬動(dòng)力學(xué)及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在孵育30min時(shí)可見ROS被RPE吞入胞漿內(nèi)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)吞噬數(shù)量不斷增加，至孵育3h，吞噬數(shù)量達(dá)到飽和；同時(shí)，在孵育過程中，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)水平不斷增加，這種吞噬動(dòng)力學(xué)與蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)的一致性提示，吞噬過程中MERTK與ROS結(jié)合后激活了下游的Ras信號(hào)通路。

為了進(jìn)一步證實(shí)這一假設(shè)，本研究組采用RNA干擾技術(shù)將RPE細(xì)胞的Ras基因沉默后，再次進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)并測(cè)定吞噬變化及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在孵育過程中，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，siRas-RPE細(xì)胞結(jié)合ROS的數(shù)量明顯增加，而吞入ROS的數(shù)量極少，僅在孵育180min時(shí)可觀察到少量ROS吞入了RPE細(xì)胞內(nèi)。與RPE細(xì)胞相比，siRas-RPE細(xì)胞結(jié)合ROS的數(shù)量無明顯變化，而吞入ROS的數(shù)量下降了97%(圖7)。同時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表達(dá)水平維持低值且不隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而變化(灰度比值均<0.5)。比較孵育120min及180min后正常RPE細(xì)胞與siRas-RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)水平，更可清晰地看到siRas-RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)水平的明顯下降。siRas-RPE細(xì)胞吞噬動(dòng)力學(xué)與MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)水平的一致變化，提示RPE細(xì)胞吞噬ROS過程是通過啟動(dòng)MERTK-Ras-MEK-MLCK通路來重排肌球蛋白來完成的。

另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)，正常RPE細(xì)胞孵育過程中隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，RPE細(xì)胞結(jié)合及吞入ROS的數(shù)量不斷增加，同時(shí)MERTK蛋白的表達(dá)水平也隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；而siRas-RPE細(xì)胞孵育過程中隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)結(jié)合ROS的數(shù)量逐漸增加，但吞入ROS數(shù)量極少，并且MERTK蛋白的表達(dá)水平也未隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，siRas-RPE細(xì)胞的這種變化趨勢(shì)與MERTK基因突變的RCS鼠相似：RCS鼠由于MERTK基因突變而表達(dá)無功能的MERTK蛋白，所以雖然可以結(jié)合ROS但是卻存在攝入ROS的明顯異常[5]，從而發(fā)生視網(wǎng)膜色素變性。這就從另一角度提示Ras可能為MERTK啟動(dòng)的下游信號(hào)這一結(jié)論。至于Ras干擾后MERTK蛋白表達(dá)水平降低的原因尚待進(jìn)一步研究，分析可能的原因應(yīng)與受體酪氨酸蛋白激酶各個(gè)復(fù)雜的下游通路之間的相互作用有關(guān)[15]。

為了明確RCS鼠是否因MERTK異常而無法啟動(dòng)下游的Ras信號(hào)通路，從而進(jìn)一步證實(shí)RPE細(xì)胞吞噬過程中MERTK-Ras信號(hào)通路的存在，本研究用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默RPE細(xì)胞的MERTK基因來模擬RCS鼠的RPE細(xì)胞狀態(tài)，再次進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)并測(cè)定吞噬變化及吞噬過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在全部孵育過程中siMERTK-RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白始終維持在較低的表達(dá)水平(灰度比值均<0.5)，比較孵育120min及180min后正常RPE細(xì)胞與siMERTK-RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)水平，也可看到siMERTK-RPE細(xì)胞MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)水平的降低。這與siRas-RPE細(xì)胞孵育過程中MERTK、Ras、MEK、MLCK的蛋白表達(dá)變化保持一致，證實(shí)Ras確為MERTK啟動(dòng)的下游信號(hào)。

當(dāng)然，本研究采用的是質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾Ras及MERTK基因及蛋白的表達(dá)，雖然進(jìn)行了多個(gè)序列篩選、采用效果最佳的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但仍不能完全沉默Ras及MERTK基因及蛋白的表達(dá)(圖3)，加上目前檢測(cè)蛋白表達(dá)的免疫印跡方法也只能通過灰度比值這一相對(duì)數(shù)值來評(píng)估，所以研究結(jié)果存在無法避免的誤差。

但是，無論如何本研究初步探討了鼠RPE細(xì)胞吞噬功能與MERTK-Ras-MEK-MLCK通路的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)正常鼠RPE細(xì)胞在吞噬ROS過程中MERTK、Ras、MEK及MLCK蛋白表達(dá)增加(灰度比值>0.5)，而干擾了MERTK及Ras基因表達(dá)后RPE細(xì)胞在吞噬ROS過程中MERTK、Ras、 MEK及MLCK蛋白表達(dá)維持在較低水平，且不隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而增加(灰度比值均<0.5)，從而證實(shí)RPE細(xì)胞通過受體酪氨酸激酶MERTK激活下游Ras、MEK及MLCK通路，引起肌球蛋白重排完成吞噬功能，進(jìn)一步闡明了RPE細(xì)胞吞噬機(jī)制，為今后視網(wǎng)膜色素變性的治療提供了新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1 Mayerson PL, Hall MO.Rat retinal pigment epithelial cells show specificity of phagocytosisinvitro.JCellBiology1986;103(1):299-308

2 Feng W, Yasumura D, Matthes MT,etal. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells.JBiolChem2002;277(19):17016-17022

3 Nandrot EF, Silva KE, Scelfo C,etal. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin.BiolCell2012;104(6):326-341

4 Seitz HM, Camenisch TD, Lemke G,etal. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells.JImmunol2007;178(9):5635-5642

5 Strick DJ, Feng W, Vollrath D. Mertk drives myosin Ⅱ redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis.InvestOphthalmolVisSci2009;50(5):2427-2435

6 Graham DK, Dawson TL, Mullaney DL,etal. Cloning and mRNA expression analysis of a novel human protooncogene, c-mer.CellGrowthDiffer1994;5(6):647-657

7 Kopec AM, Carew TJ. Growth factor signaling and memory formation: temporal and spatial integration of a molecular network.LearnMem2013;20(10):531-539

8 Nguyen DH, Catling AD, Webb DJ,etal. Myosin light chain kinase functions downstream of Ras/ERK to promote migration of Urokinase-type plasminogen activator-stimulated cells in an integrin-selective manner.JCellBiol1999;146(1):149-164

9 Hu WY, Han YJ, Gu LZ,etal.Involvement of Ras-regulated myosin light chain phosphorylation in the captopril effects in spontaneously hypertensive rats.AmJHypertens2007;20(1):53-61

10 Papermaster DS, Dreyer WJ. Rhodopsin content in the outer segment membranes of bovine and frog retinal rods.Biochemistry1974；13(11):2438-2439

11孫昱昭，洪晶.雙重?zé)晒鈽?biāo)記法檢測(cè)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬的功能.國(guó)際眼科雜志2006;6(1)：42-46

12 Yue J, Mulder KM.Requirement of Ras/MAPK pathway activation by transforming growth factor beta for transforming growth factor beta 1 production in a Smad-dependent pathway.JBiolChem2000; 275(40):30765-30773

13 McCubrey JA, Steelman LS, Abrams SL,etal. Roles of the RAF/MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT pathways in malignant transformation and drug resistance.AdvEnzymeRegul2006;46:249-279

14 Shelby SJ, Colwill K, Dhe-Paganon S,etal.MERTK interactions with SH2-domain proteins in the retinal pigment epithelium.PLoSOne2013;8(2):e53964

15 Sasaki T, Hiroki K, Yamashita Y. The role of epidermal growth factor receptor in cancer metastasis and microenvironment.BiomedResInt2013;2013:546318

Yu-Zhao Sun, Ruo-Shuang Zhang, Feng Gu

Foundation item:Science and Technology Planning Project of Shenyang (No. F13-316-1-11)

Department of Ophthalmology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Correspondence to:Yu-Zhao Sun. Department of Ophthalmology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. sunyz91667@sina.com

Received：2015-10-16Accepted：2015-12-20

Abstract

?AIM:To investigate relation between the phagocytic fuction of retinal pigment epithelial (RPE) cells and the signal transduction pathway of MERTK-Ras-extracellular signal regulated kinase kinase(MEK)-myosin light chain kinase(MLCK)-myosin.

?METHODS: Cultured 3～5 passage RPE cells of C57BL/6 mouse were incubated with rod outer segments (ROS) suspension (containing ROS 1×107/ml) at 37℃, then cells were rinsed at different times(30,60,120,180,240min) to terminate the phagocytosis. The kinetics of phagocytosis was measured by double-fluorescent labeling. The activity levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK at different incubation times were measured by Western Blot with antibodies of MERTK, Ras and phospho-antibodies of MEK and MLCK, respectively. To repeat the measurement of the phagpcytic kinetics and activity levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK at different incubation times after interference to Ras and Mertk gene in RPE cells by plasmid transfection.

?RESULTS: The phagocytic kinetics showed that the ingestion occurred at 30min of incubation. Ingested ROS by RPE cells increased until saturated at 180min. The protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK in RPE cells increased during all the incubation periods compared with control group(P<0.05). After interference to Ras and MERTk gene in RPE cells by plasmid transfection, the protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK and the quality of ingested ROS sustained at the lower levels during all the incubation periods, only a few ingested ROS were seen at 180 min. Compared with untransfected RPE cells, the protein levels of MERTK, Ras, MEK and MLCK and the quality of ingested ROS in siRas-RPE cells and siMERTK-RPE cells decreased distinctly at 120 min and 180 min during incubation(P<0.05).

?CONCLUSION: Ras-MEK-MLCK-myosin signal pathway is the downstream of MERTK receptor in the phagocytic process of RPE cells from mice.

KEYWORDS:?retinal pigment epithelium;phagocytosis; MERTK; Ras; myosin

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.07

收稿日期：2015-10-16 修回日期： 2015-12-20

通訊作者：孫昱昭.sunyz91667@sina.com

作者簡(jiǎn)介：孫昱昭，畢業(yè)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，眼科學(xué)博士，副教授，研究方向：視網(wǎng)膜變性基礎(chǔ)研究、眼表角膜病的基礎(chǔ)和臨床研究。

基金項(xiàng)目：沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.F13-316-1-11)
作者單位：(110001)中國(guó)遼寧省沈陽市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院眼科