堿性pH對馬鮫魚肌球蛋白熱聚集行為的影響

哈斯，韓玲鈺，許喆，馬堃，李婷婷

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

馬鮫魚（Scomberomorus niphonius）又被稱作鲅魚，它是東海、南海、黃海和北太平洋漁業(yè)中的重要物種，在中國的消費(fèi)者和生產(chǎn)者中廣受歡迎[1]。馬鮫魚含有許多有益于健康飲食的營養(yǎng)物質(zhì)，包括優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)（23%）、多不飽和脂肪酸（占其總脂肪酸含量的71.1%～80.9%）、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)[2]。馬鮫魚主要分為食用生鮮、魚糜制品、魚罐頭等幾類，其中魚糜制品占較大比重[3]。魚糜經(jīng)過熱處理形成凝膠，肌球蛋白（myosin）是最重要的功能性蛋白，加熱可使肌球蛋白變性，暴露的活性基團(tuán)間相互作用形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)在肉蛋白熱聚集過程中，肌球蛋白發(fā)揮著十分重要的作用，作為肉蛋白中含量高達(dá)50%的蛋白質(zhì)，它的熱聚集很容易受到pH、鹽濃度和溫度的影響，通常用濁度、溶解度、表面疏水性、總巰基含量、α-螺旋含量等探究其熱聚集性質(zhì)[6]。作為一種鹽溶性蛋白質(zhì)，肌球蛋白形狀如“Y”字，頭部是兩個球形結(jié)構(gòu)，尾巴是桿狀，其中兩個頭部對堿處理很敏感[7]。肌球蛋白分子頭部與肌動蛋白相連，桿狀尾部暴露在外[8]，對鯉魚[9]、馬鮫魚[10]的肌動球蛋白熱變性機(jī)制相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)肌球蛋白在加熱的過程傾向于變性聚集是由于肌球蛋白暴露在外的尾部；從新鮮緋鯢鰹和冷藏9 d的緋鯢鰹中提取肌球蛋白，對其濁度、表面疏水性和二硫鍵等指標(biāo)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新鮮的緋鯢鰹在35～75 ℃范圍內(nèi)聚集程度更高[11]。因此，進(jìn)一步研究堿性pH下熱處理對肌球蛋白功能性質(zhì)的影響具有很大的潛力。

植物源和乳源蛋白質(zhì)在食品加工中已作為乳化劑廣泛應(yīng)用，是由于它們在加工和貯藏過程中具有很好的穩(wěn)定性。雖然肉蛋白也具有較好的乳化性，但是由于加熱可以使其聚集變性，致使肉蛋白形成的乳液穩(wěn)定性較差。在食品加工生產(chǎn)過程中加熱處理是十分常見的操作流程，因此，研究肉蛋白的熱聚集性質(zhì)可以更好的了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)之間的關(guān)系，通過不同pH環(huán)境改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而改善其乳化性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鮫魚購于大連樂購超市，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，對魚進(jìn)行處理，取其背部白肉，用榨汁機(jī)制成肉糜狀，用去離子水清洗，4 ℃冷藏備用。

腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽水合物（ATP），上海麥克林有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷（TRIS）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、馬來酸，北京索萊寶有限公司；β-巰基乙醇，上海阿拉丁有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外/可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；IKA T18高速均質(zhì)機(jī)，德國ULTRA-TURRAX公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；圓二色光譜儀（Chirascan），英國應(yīng)用光物理公司；IR Affinity-1傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津SHIMADZU。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白提取

提取肌球蛋白依據(jù)蓋靜[12]的方法并稍作修改，實(shí)驗(yàn)過程中反應(yīng)均在4 ℃下進(jìn)行，離心機(jī)設(shè)置為4 ℃。將提前準(zhǔn)備好的肉糜加入10倍體積的試劑一（0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris，鹽酸調(diào)pH至7.0），冰水浴下用IKA T18在轉(zhuǎn)速為11000 r/min下均質(zhì)5 min，反應(yīng)15 min后5320 r/min離心5 min；將沉淀物與試劑二（0.45 mol/L KCl，0.2 mol/L乙酸鎂，1 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris，5 mmol/Lβ-巰基乙醇，馬來酸調(diào)pH至6.8）1:5混合，將ATP加入向上述溶液中，調(diào)節(jié)終濃度為10 mmol/L，充分混合后靜置90 min；然后在10180 r/min離心13 min；將5倍體積的1 mmol/L KHCO3加入離心后的上清液中，放置20 min，10180 r/min離心13 min，將在沉淀物與試劑三（0.5 mol/L KCl，20 mmol/L Tris，5 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH用鹽酸調(diào)至7.5）1:2.5混合，反應(yīng)10 min后再加入5倍體積的1 mmol/L KHCO3，將MgCl2加入溶液中，最終濃度為10 mmol/L，在4 ℃冰箱過夜反應(yīng)，次日10180 r/min離心25 min，得到肌球蛋白沉淀。使用緩沖液[0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）]對肌球蛋白進(jìn)行溶解，6860 r/min離心10 min，上清液于4 ℃待用。測定肌球蛋白純度使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.3.2 肌球蛋白溶液制備

取1.3.1制備的溶液，分為三組調(diào)節(jié)pH，各組在時間上保持一致，同時為了檢測肌球蛋白的熱聚集性質(zhì)，上述三組蛋白液均置于75 ℃水浴鍋中水浴加熱30 min，對照組作為對照。加熱前后的肌球蛋白溶液放置于4 ℃恒溫冷庫中保留待用。

1.3.3 蛋白濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定采用雙縮脲法，使用BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1 mL肌球蛋白溶液與4 mL雙縮脲試劑并混合反應(yīng)，30 min后于540 nm下測定吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肌球蛋白濃度。

1.3.4 溶解度測定

肌球蛋白溶液的溶解度參考李婷[13]的方法，并稍作修改，對1.3.1中肌球蛋白溶液進(jìn)行溶解度測定。

1.3.5 濁度測定

參考韓敏義等[14]的方法略有修改，肌球蛋白濃度為1 mg/mL，混勻靜置10 min，在350 nm測定其吸光度。

1.3.6 圓二色譜測定

用緩沖液（0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl）稀釋未經(jīng)過和經(jīng)過熱處理的不同pH肌球蛋白溶液至濃度為0.2 mg/mL，比色皿光徑1 mm，掃描波段為190～250 nm，緩沖液作為空白[15]。肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)用儀器自帶軟件CDNN 2.1分析。

1.3.7 傅里葉紅外光譜（FT-IR）測定

根據(jù)Liu等[16]的方法，將不同組的肌球蛋白溶液使用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，將溴化鉀與凍干后的肌球蛋白粉末混合（50:1），壓力為18 MPa，時間2 min，掃描范圍為450～4000 cm-1。

1.3.8 總巰基含量測定

根據(jù)朱東宏等[17]的方法，進(jìn)行了一定的修改，將1 mL蛋白溶液（5 mg/mL）與9 mL緩沖液（50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA，pH 7.0）均勻混合。取0.5 mL DTNB（0.1%）與上述溶液4.5 mL與混合，4 ℃靜置30 min，在412 nm測定吸光值。通過下式計(jì)算：

式中：

C0——巰基含量；

A——412 nm處吸光值；

D——稀釋倍數(shù)；

c——蛋白溶液濃度；

ε——摩爾消光系數(shù)13600 mol·cm/L。

1.3.9 表面疏水性

根據(jù)Benjakul等[18]的方法，將1 mg/mL肌球蛋白溶液稀釋成0.125、0.25、0.5 mg/mL。將4 mL肌球蛋白溶液分別加入20 μL ANS溶液，ANS溶液配制為10 mmol/L ANS、20 mmol/L Tris，pH調(diào)至7.5，混合避光10 min。用酶標(biāo)儀在激發(fā)波303 nm，發(fā)射波485 nm測定上述溶液的熒光強(qiáng)度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，直線斜率即為肌球蛋白的表面疏水性。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)做三次平行，圖形繪制：Origin 2018；數(shù)據(jù)進(jìn)行整理：Microsoft Excel 2019；數(shù)據(jù)顯著性分析：SPSS 26，圖中不同字母為差異顯著（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果分析

如圖1所示，SDS電泳圖譜可以顯示肌球蛋白純度，提取的肌球蛋白分子量是由44.3 ku以下的肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈和200 ku的肌球蛋白重鏈組成，通過Gel-pro analyzer定量分析軟件肌球蛋白的純度在80%以上。

2.2 溶解度

溶解度是反應(yīng)蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的重要參數(shù)。如圖2所示，對照組的肌球蛋白溶解度隨著pH的升高，從68.00%升高到82.00%。肌球蛋白的等電點(diǎn)為5.5，pH的改變會使蛋白質(zhì)攜帶更多的負(fù)電荷，致使蛋白質(zhì)間的靜電斥力增加[19]。pH越大，靜電斥力越高。pH升高帶來的靜電電荷將會結(jié)合更多的水分子，而且靜電斥力也會影響肌球蛋白發(fā)生聚集[20]。NaCl對肌球蛋白的溶解度也有較大影響，Cl-與肌球蛋白相結(jié)合，增加蛋白質(zhì)之間的靜電斥力，這會抑制肌球蛋白發(fā)生聚集[21]。Sun等[22]在研究pH變化對藍(lán)鰭金魚骨骼肌肌球蛋白構(gòu)象和凝膠性質(zhì)的影響時，當(dāng)0.5 mol/L NaCl的存在時，觀察到該拋物線形狀溶解度曲線，pH＞8.0或pH＜3.0時，觀察到溶解度的急劇增加，這與我們對照組結(jié)果是一致的。但是，加熱組溶解度隨pH的升高變化較為明顯，從30.00%增加到94.00%（p＜0.05)，這可能是因?yàn)榧訜峥梢越o系統(tǒng)帶來更多的能量，使蛋白質(zhì)之間更容易相互碰撞，因此Cl-與肌球蛋白的結(jié)合作用可能就被削弱，而pH引起的分子間的靜電斥力成為影響肌球蛋白的主要因素。可以看出在75 ℃，30 min條件下，大量肌球蛋白的熱聚集體形成，如圖2所示，肌球蛋白單體在加熱后發(fā)生聚集，部分聚集體可以在溶液中溶解，但是部分則變得不溶。因此，加熱后pH 9.0的肌球蛋白溶液溶解度高于其他組可能是因?yàn)樯闪烁嗟目扇苄跃奂w。

2.3 濁度

濁度是評價肌球蛋白聚集性的主要指標(biāo)，濁度的增加表明肌球蛋白聚集體的形成[23]。如圖3所示，對照組肌球蛋白的濁度基本上沒有變化（p＞0.05），可以表明肌球蛋白在未加熱條件下的聚集程度較低。然而，加熱組的濁度明顯大于對照組，表明肌球蛋白發(fā)生熱聚集，但吸光值從0.49降低到0.23，表明有可溶性聚集體產(chǎn)生。Brenner等[24]在魚類肌球蛋白中也有類似的發(fā)現(xiàn)，他們的解釋是肌球蛋白聚集體的摩爾質(zhì)量減少了。根據(jù)Ferrone[25]的研究表明，只有當(dāng)肌球蛋白單體達(dá)到一定濃度時，肌球蛋白溶液才會發(fā)生聚集。但是，當(dāng)pH從7.0增加到9.0時，蛋白質(zhì)之間的靜電斥力增強(qiáng)阻礙了這個濃度的形成，減少了肌球蛋白的熱聚集，增強(qiáng)了光散射和透光性，使肌球蛋白的濁度降低，形成了不同摩爾質(zhì)量的肌球蛋白聚集體?？傊?，在加熱和pH 9.0的條件下，肌球蛋白聚集程度更低，而且更加復(fù)雜。根據(jù)溶解度的結(jié)果，在高靜電斥力條件下，肌球蛋白可溶性聚集體可能更容易形成。

2.4 圓二色譜

圓二色譜（CD）可以測定肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)含量，通過CD譜圖討論加熱條件下堿性pH對馬鮫魚肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，肌球蛋白的“Y”形結(jié)構(gòu)中桿狀尾部是由α-螺旋盤繞而成[26]。肌球蛋白在208 nm和222 nm處的負(fù)峰通常被人作為α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域[27]。表1是不同pH處理對肌球蛋白加熱前后的二級結(jié)構(gòu)變化，可以看出肌球蛋白經(jīng)過加熱后α-螺旋含量明顯減少，β-折疊含量增加。蛋白質(zhì)經(jīng)過熱處理后α-螺旋含量減少，這是由于蛋白質(zhì)分子展開的程度增加；β-折疊含量增加，是由于蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加[28]。如圖4所示，對照組的肌球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)在pH增加下沒有發(fā)生明顯變化（p＞0.05），這可能因?yàn)棣?螺旋結(jié)構(gòu)主要分布在肌球蛋白的桿狀尾部，對pH的變化不敏感。但是加熱組的變化較為明顯，pH 9.0的α-螺旋最低，這是因?yàn)榧∏虻鞍自跓崽幚砗?，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，大量α-螺旋在高溫下展開，Liu等[29]也得出類似的結(jié)果。

2.5 傅里葉紅外光譜

傅里葉紅外光譜（FT-IR）可以通過酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在1664 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰是酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動。本研究對熱聚集過程中涉及的α-螺旋β-折疊二級結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行了分析，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與峰值有以下的對應(yīng)關(guān)系：1661～1680 cm-1表示α-螺旋結(jié)構(gòu)，1610～1639 cm-1表示β-折疊結(jié)構(gòu)[30]。從圖5中可以看出，不同pH處理對肌球蛋白加熱前后的FT-IR峰型基本一致，峰位置也基本一致。Liu等[31]發(fā)現(xiàn)α-螺旋的展開和β-折疊的增加會使豬肌球蛋白凝膠化變的更容易，而且經(jīng)過加熱后的肌球蛋白形成聚集體過程中都會存在α-螺旋減少、β-折疊增多的現(xiàn)象，其中肌球蛋白的展開會使α-螺旋減少[32]。羰基（C=O）和氨基（-NH2）之間的氫鍵可以使α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過35 ℃，氫鍵逐漸被破壞，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)減少[33]，這與圓二色譜得出的結(jié)論是一致的。

2.6 巰基含量

pH改變、熱處理等因素的變化會改變蛋白質(zhì)分子的三級和四級結(jié)構(gòu)，而巰基含量的變化則可以被用來表征蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)的變化[34]。巰基分為活性巰基和隱藏的巰基，活性巰基位于肌球蛋白頭部，它是蛋白質(zhì)最具活性的功能基團(tuán)，但容易被氧化成二硫鍵[35]。不同pH處理肌球蛋白加熱前后巰基含量如圖6所示，對照組pH 7.0時肌球蛋白的巰基含量低于其他組，隨著pH的升高其含量增加。但是，經(jīng)過加熱的肌球蛋白則相反，巰基含量隨著pH升高而減小。這是由于在堿性條件下，蛋白質(zhì)展開使其內(nèi)部大量的基團(tuán)（包括疏水基團(tuán)和巰基基團(tuán)）顯露出來，且在此條件下有助于巰基向分子間和分子內(nèi)二硫鍵轉(zhuǎn)化[36]。巰基含量的增加或減少可能是一種動態(tài)平衡，加熱可以促進(jìn)這一過程，使巰基更快的向二硫鍵的轉(zhuǎn)化。因此，加熱后pH 9.0巰基含量較低可能由于巰基大量轉(zhuǎn)化為二硫鍵，二硫鍵的形成致使大分子聚集發(fā)生聚集，一些表面的巰基重新被掩蓋，導(dǎo)致巰基含量變低。綜上所述，二硫鍵是蛋白質(zhì)在pH 9.0下形成可溶性聚集體的重要因素之一。

2.7 表面疏水性

表面疏水性和巰基含量一樣，也可以用來分析蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)的變化[37]。蛋白質(zhì)加熱后變性導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開使更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來使表面疏水性增加，同時暴露的疏水氨基酸殘基可以促進(jìn)疏水相互作用從而使蛋白發(fā)生聚集[38]。如圖7所示，隨著pH值的增加，對照組肌球蛋白的表面疏水性系數(shù)依次增加，而加熱組下降。但是加熱組肌球蛋白的表面疏水性系數(shù)仍高于對照組的（p＜0.05）。事實(shí)上，根據(jù)報(bào)道肌球蛋白的尾部對堿性不敏感[39]。這就是說肌球蛋白疏水性與ANS吸附間的正比例關(guān)系反映的主要是肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)的變化。肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)展開，許多內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來。經(jīng)過加熱，疏水基團(tuán)變得更加暴露，加速了與ANS的結(jié)合，使疏水性增加，肌球蛋白疏水性的增加是凝膠形成和大肌球蛋白聚集體形成的必要條件[40]。長時間加熱大大增加了肌球蛋白的表面疏水性，但隨著pH增加，這種現(xiàn)象逐漸減弱。表面疏水性的降低，在研究pH對蝦夷扇貝肌動球蛋白理化性質(zhì)和熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響也有類似的結(jié)論[41]。結(jié)合巰基含量的變化我們可以知道，堿性pH影響肌球蛋白頭部的三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)和頭部-頭部的相互作用，使形成的肌球蛋白聚集體發(fā)生改變。由于二硫鍵和高暴露的疏水性基團(tuán)可能會為肌球蛋白的聚集提供獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。然后借助靜電斥力和其他作用力，使得可溶性聚集體大量存在于pH 9.0處理的溶液中。

3 結(jié)論

不同pH（7.0、8.0、9.0）下肌球蛋白熱聚集存在一定差異，通過改變pH可以控制蛋白質(zhì)的熱聚集行為，可以改善肌球蛋白溶液溶解度和濁度。肌球蛋白熱聚集過程中由于蛋白質(zhì)變性使其二級結(jié)構(gòu)與對照組相比發(fā)生明顯變化。結(jié)合巰基含量和表面疏水性結(jié)果，在堿性pH處理下，肌球蛋白變得更加開放，許多內(nèi)部疏水基暴露。長時間加熱可使蛋白質(zhì)的展開和基團(tuán)暴露得到進(jìn)一步加強(qiáng)。加熱組pH 9.0有大量可溶性聚集體產(chǎn)生，并且顯示出了很好的熱穩(wěn)定性。綜上所述，通過探究堿性條件下肌球蛋白熱聚集體的性質(zhì)，有助于我們對其熱聚集進(jìn)行調(diào)控，獲得一種熱穩(wěn)定性較好的肌球蛋白溶液，對以后研究其作為乳化劑添加到食品中有重要意義。