氣相色譜法測定吐魯番無核白葡萄樹傷流液組成多糖的單糖

·中藥及天然藥物·

氣相色譜法測定吐魯番無核白葡萄樹傷流液組成多糖的單糖

艾爾肯·依不拉音1，布熱米古麗·買買提2，米爾扎提·麥麥提3

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830011；2.新疆喀什地區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，喀什844000； 3.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊830011)

摘要：目的對吐魯番葡萄樹傷流液多糖進行分離純化，并分析其單糖組成。方法采用醇沉法提取多糖，Sevage法脫蛋白，經DEAE-52纖維素柱及Sephadex G-150凝膠柱分離純化，采用氣相色譜分析單糖組成。結果用體積分數(shù)80%乙醇沉淀、Sevage法除蛋白，得葡萄樹傷流液粗多糖，粗多糖經過DEAE-52纖維素柱分離得到8個多糖組分,編號分別為：組分-1，組分-2，組分-3，組分-4，組分-5，組分-6，組分-7，組分-8。其中4個多糖組分經過Sephadex G-150純化后，通過GC分析組分-1和組分2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；組分-3含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；組分-5含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。結論該方法可較好地分離純化葡萄樹傷流液多糖。采用GC分析多糖的單糖組成，研究結果適用于多糖中的單糖組成分析。

關鍵詞：葡萄樹傷流液；多糖；分離；純化；單糖組成；氣相色譜

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.001

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0221-04

Abstract:ObjectiveThe aim was to analyze the polysacchardes in Turfan grapevine bleeding sap. MethodsCrude polysaccharide was prepared by using alcohol precipitation and improved Sevage method. The obtained crude polysaccharide was purified by DEAE-52 and Sephadex G-150 column chromatography. The monosaccharide composition was analyzed by gas chromatography. Results 8 polysaccharides were obtained:components-1，components-2，components-3，components-4，components-5，components-6，components-7 and components-8； After purified， 4 polysaccharides eluting peaks were identified. From the result obtained by GC analysis，components-1 and components-2 contained rhamnose， arabinose， xylose， mannose， glucose and galactose； components-3 contained rhamnose， arabinose， glucose， mannose， and galactose； components-5 contained rhamnose， mannose， glucose and galactose.ConclusionThis method is suitable for the separation and purification of grapevine bleeding sap polysaccharide. It is applicable to analyze the monosaccharide composition of grapevine bleeding sap polysaccharides.

基金項目：國家自然科學基金項目(編號:21162030)

收稿日期：(2014-09-30)

Analysis of polysaccharides in Turfan seedless grapevine bleeding sap by GC

Arkin IBURAIM1，Buremiguli MAIMAITI2，Mizat MAIMAITI3(1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011，China；2.Department of Pharmacy， Xinjiang of Kashgar People′s Hospital，Kashgar 844000， China； 3.College of Pubilic Health， Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Key words: grapevine bleeding sap；polysaccharides；separation；purification；simple sugars and composition；gas chromatography

在每年的3月下旬至4月中旬，生長于新疆地區(qū)的葡萄樹正處于幼葉快要發(fā)出時期，從自然或人為傷口處會流出無色透明的液體，叫作葡萄樹傷流液。它是由根壓引起的[1]，通常農民把它作為廢料而廢棄。它含有豐富的營養(yǎng)成分，鈣、鉀和谷氨酸含量較高[2]。收集葡萄樹傷流液可防止自然資源的浪費，使其變廢為寶。禹婷等[3]報道，以核桃、獼猴桃和葡萄為試材，分析和比較了3種果樹傷流液中游離氨基酸、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，葡萄樹傷流液還含有一定量的多酚、氨基酸、蛋白質、礦物質[4-5]。

多糖類化合物中的活性成分不僅可作為廣譜的免疫促進劑，調節(jié)機體免疫功能，還可在抗病毒、抗炎、抗?jié)?、抗血栓、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗輻射以及治療艾滋病和心血管疾病等方面發(fā)揮廣泛的藥理作用[6-10]。多糖生物活性廣、毒副作用小，是理想的免疫調節(jié)劑。近年來，隨著研究技術的進步，多糖研究得到不斷發(fā)展，新的多糖不斷被發(fā)現(xiàn)，其藥理作用也將被進一步深入研究[11]。到目前為止，已有300余種多糖及其活性成分從其天然產物中被分離出來，而從天然植物中提取分離的水溶性多糖最為重要[12]。有學者對新疆葡萄樹傷流液總多糖含量進行分析[13]，并對喀什木納格葡萄樹傷流液多糖分解成單糖進行分析[14]，發(fā)現(xiàn)多糖中的單糖是控制多糖質量標準的最重要環(huán)節(jié)之一。因此，多糖中的單糖分析是一項基礎研究工作。本研究對吐魯番葡萄樹傷流液中多糖進行了分離純化，研究單糖的組成及含量測定，為開發(fā)研究葡萄樹傷流液及多糖的植物資源奠定基礎。

1儀器與試藥

1.1儀器UV-2550紫外-可見分光光度儀(日本，島津)；HeraeusMultifuge X3R-離心儀(美國，賽默飛世爾科技)；GC-2010Plus氣相色譜儀(日本，島津)；Mettler Toledo電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HH-S4數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2試藥葡萄樹傷流液：2012年3月底初采自新疆吐魯番鄯善縣，冷凍保存。樣品收集方法：在葡萄樹枝自然傷口或人為傷口處，靠根壓溢出的葡萄樹傷流液接入保鮮袋進行收集，裝瓶，冷凍儲存?zhèn)溆谩］焱?、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)，均購于上海藍季科技發(fā)展有限公司；D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所，批號：110833-200302)；標準葡聚糖T系列，分別為T5、T10、T40、T70、T500、藍色葡聚糖2000(均為上海譜振生物科技有限公司產品)；鹽酸羥胺、三氟醋酸、無水乙醇均為國產分析純；濃硫酸為優(yōu)級純。

2方法

2.1粗多糖的制備醇沉法提取葡萄樹傷流液中粗多糖，葡萄樹傷流液在60℃下減壓濃縮至原體積的1/20,得濃縮液，并向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)增加到20%(除微水溶性成分)，在4 ℃下靜置12 h，離心分離(4 000 r·min-1，8 min)，留上清液儲存，備用。繼續(xù)在上述液體中添加無水乙醇，使無水乙醇體積分數(shù)提高至80%(用酒精比重計觀察)，4 ℃下放置12 h，離心分離(4 000 r·min-1，8 min)，取產生的沉淀備用。沉淀分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，用Sevage法除蛋白， 抽真空干燥后得粗多糖，供實驗使用。

2.2多糖的分離純化稱取粗多糖5 g置于200 mL燒杯中，用100 mL溫水溶解，離心分離(4 000 r·min-1，5 min)，取上清液，液體濃縮至40 mL，樣品過DEAE-52纖維素柱進行分離，用蒸餾水洗脫后，用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mol·L-1的氯化鈉溶液梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，每管收集10 mL，用蒽酮、硫酸法跟蹤檢測，在621 nm處測定吸光度。收集同一濃度鹽洗脫液至30～ 50 mL，用透析袋除鹽， 用硝酸銀(0.1 mol·L-1)檢測是否將鹽除盡。選擇高濃度4個組分分別上SephedexG-150柱進一步洗脫，流速0.5 mL·min-1，收集多糖組分，濃縮，真空干燥后得較純的8個多糖組分。

2.3單糖組成分析

2.3.1色譜條件檢測器：氫火焰檢測器；載氣：N2；色譜柱：Rtx-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱；檢測器溫度為280 ℃；進樣溫度為235 ℃；H2：流速為40 mL·min-1；分流比為10∶1；尾吹250 mL·min-1；進樣量:1.0 μL。

2.3.2單糖對照品的乙酰化分別精確稱取干燥至恒質量Man、Rha、Glc、Gal、Xyl和Ara 10 mg單糖對照品于試管中，加入0.5 mL吡啶，用10 mg鹽酸羥胺混勻后封管，90 ℃水浴中反應30 min，冷卻至室溫，加0.5 mL醋酸酐，混勻，封管，繼續(xù)在90 ℃水浴中反應30 min，進行?；磻?，用氮氣在60 ℃水浴中吹干，1.0 mL氯仿溶解，按2.3.1項下條件進行氣相色譜分析(見圖1)。

2.3.3樣品的乙酰化分別取組分-1，組分-2，組分-3和組分-5各5 mg，置于試管中，加入2.0 mL 4.0 mol·L-1三氟乙酸，混勻，充氮氣，封閉。在100 ℃水浴中加熱水解12 h，水解完成后，在60 ℃水浴用氮氣吹干，將得到的反應產物，加乙醇反復吹干除三氟乙酸，水解完成后的多糖按2.3.2項下方法將多糖進行乙酰化，再進行氣相色譜分析。根據(jù)圖2的出峰時間和峰面積確定多糖中單糖個數(shù)及其摩爾比。

3結果

3.1DEAE-52纖維素柱分離由DEAE-52洗脫可知，DEAE-52纖維素層析柱對葡萄樹傷流液多糖的分離效果好，吐魯番葡萄樹傷流液多糖分離得到8個多糖組分，分別為水洗脫組分-1，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mol·L-1氯化鈉溶液洗脫組分2至組分8。

DEAE-52纖維素柱分離結果顯示，水洗脫組分-1，氯化鈉溶液洗脫組分-2，組分-3和組分-5中多糖含量較高，便于組成分析，因此，選用上述4種高含量多糖進行單糖組成分析，粗多糖的進一步純化按2.2項下處理。

3.2SephadexG-150對多糖組分純化結果DEAE-纖維素52分離純化后得到的多糖組分-1、組分-2、組分-3、組分-5，并進行進一步分離純化。經過DEAE-52纖維素柱分離后的各個組分再經SephadexG-150柱層析進行進一步分離，結果均顯示單峰，說明這些組分較單一。收集所得各洗脫組分，水解處理后進行氣相色譜分析，所得多糖的單糖組成見圖1。通過單糖混合對照品氣相色譜圖(圖1A)可以看出，單糖色譜峰間沒有重疊，為葡萄樹傷流液中多糖中組成單糖成分的分析奠定良好的基礎。

圖1多糖組分氣相色譜圖

A.單糖混合對照品；B.組分-1；C.組分-2；D.組分-3；E.組分-5；1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖.

Fig.1Gas chromatogramsofpolysaccharide components

A.standard monosaccharide；B.component-1；C.component-2；D.component-3；E.component-5； 1.rhamnose；2. arabinose；3. xylose；4. mannose；5.glucose；6.galactose.

3.3單糖組成分析組分-1按峰高比大小依次排列為半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖；組分-2按峰高比大小依次排列為半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖，但峰高比值與組分-1相比稍低；組分-3按峰高比大小依次排列為半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖；組分-5按峰高比大小依次排列為半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖，其中葡萄糖的峰高比與甘露糖的峰高比幾乎相等。

通過氣相色譜數(shù)據(jù)，定量分析分離純化所得吐魯番木納格葡萄樹傷流多糖組分-1、組分-2、組分-3號、組分-5號的組成峰高比見表1。其中多糖中含量最低的單糖設峰高比為1。

表1吐魯番葡萄樹傷流液多糖的單糖組分氣相色譜分析結果

Tab. 1 Monosaccharide composition of polysaccharides in Turpan grapes bleeding sap analyzed by GC

單糖RhaAraXylManGlcGal組分-13.34.21.01.72.05.0組分-21.62.11.01.32.32.9組分-32.22.1—1.01.92.5組分-51.0——1.21.11.4

注：—表示未含或微量測不出。

4討論

本實驗通過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-150柱色譜，對吐魯番葡萄樹傷流液粗多糖進行分離純化，得到相對分子質量較均勻的4個多糖組分，分別為組分-1、組分-2、組分-3、組分-5。使用氣象色譜進行單糖組成分得知，多糖組分-1和組分-2是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，組分-1含量峰高比為3.3∶4.2∶1.0∶1.7∶2.0∶5.0，組分-2含量峰高比為1.6∶2.1∶1.0∶1.3∶2.3∶2.9。組分-3是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，含量峰高比為2.2∶2.1∶1.0∶1.9∶2.5。組分-5由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其峰高比為1.0∶1.2∶1.1∶1.4。研究結果為今后開發(fā)、利用和評價天然資源提供了科學依據(jù)。

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