線粒體靶向DQA-DOX連接物的制備及其逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥活性研究

線粒體靶向DQA-DOX連接物的制備及其逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥活性研究

宋彥峰，滕增輝，崔晗，劉道洲，葉威良，張邦樂，周四元*

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，西安710032)

摘要：目的為尋找線粒體靶向的抗腫瘤藥物，將阿霉素(doxorubicin，DOX)與地喹氯銨(dequalinium,DQA)連接形成DQA-DOX，觀察DQA-DOX的抗腫瘤作用。方法合成DQA-DOX連接物，通過MTT、細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)對(duì)DQA-DOX進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究。結(jié)果細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示：與游離DOX相比，DQA-DOX對(duì)A549細(xì)胞的毒性比游離DOX明顯低，但DQA-DOX對(duì)耐DOX細(xì)胞MCF-7/ADR細(xì)胞的毒性比游離DOX顯著增強(qiáng)。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示：MCF-7/ADR細(xì)胞給予游離DOX后，DOX在細(xì)胞漿和細(xì)胞核分布得很少；MCF-7/ADR細(xì)胞給予DQA-DOX后，DQA-DOX特異性地分布于線粒體。結(jié)論DQA-DOX具有對(duì)抗阿霉素耐藥作用，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：地喹氯銨;阿霉素;線粒體;多藥耐藥

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.019

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2015)03-0283-04

Abstract:ObjectiveIn order to find mitochondrial targeting anti-tumor molecule, DQA-DOX conjugate was synthesized and its antitumor activity was evaluated. Methods The anti-tumor activity of DQA-DOX in vitro was studied by MTT method. Subcellular distribution of DQA-DOX in MCF-7/ADR cells was observed with confocal laser scanning microscopy. Result DQA-DOX showed lower cytotoxicity as compared with free DOX on A549 cells. However, on MCF-7/ADR cells, DQA-DOX exhibited higher cytotoxicity as compared with free DOX. DQA-DOX mainly distributed in MCF-7/ADR cells of mitochondria. Conclusion DQA-DOX can overcome the resistant of DOX on MCF-7/ADR cells. DQA-DOX is worthy of further investigation.

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2013JQ4026)

作者簡(jiǎn)介：宋彥峰，男，碩士研究生

收稿日期：(2014-12-02)

Preparation and anti-tumor activity of mitochondrial targeting DQA-DOX conjugate

SONG Yanfeng, TENG Zenghui, CUI Han, LIU Daozhou,YE Weiliang, ZHANG Bangle, ZHOU Siyuan*(Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China)

Key words: dequalinium; doxorubicin; mitochondria; multi-drug resistance

*通信作者：周四元，男，教授

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，但由于其心臟毒性及耐藥率高嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。DOX的主要作用機(jī)制包括抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、破壞DNA以及誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生[1-3]。腫瘤細(xì)胞新陳代謝非常旺盛，因此需要更多的能量；當(dāng)藥物直接干擾線粒體的呼吸鏈會(huì)最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。因此，靶向損傷線粒體具有對(duì)抗腫瘤細(xì)胞耐藥的潛力[4-8]。DOX在線粒體累積能夠引起活性氧的產(chǎn)生以及線粒體呼吸鏈的破壞，最終導(dǎo)致線粒體脂質(zhì)氧化以及細(xì)胞色素C釋放增加。由于線粒體膜具有高的負(fù)電性，因此，具有高脂溶性與強(qiáng)正電性特征的脂質(zhì)陽(yáng)離子可選擇性地蓄積于線粒體。地喹氯銨(dequalinium，DQA)是一種對(duì)線粒體具有高親和力的脂質(zhì)陽(yáng)離子，將它連接到小分子藥物上或者遞藥系統(tǒng)中有可能發(fā)揮線粒體靶向的作用。因此，本文通過將DQA與DOX以化學(xué)鍵相連合成一種新型的具有線粒體靶向作用的DOX衍生物DQA-DOX，并觀察其抗腫瘤活性。

1儀器與材料

1.1儀器INOVA-400 MHz 型超導(dǎo)核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)；Waters Quatro-premier質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters 公司)；Leica TCS SP2-激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Awareness公司)。

1.2材料二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺(TEA)、丁二酸酐，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；地喹氯銨(DQA)購(gòu)自寧波億諾化學(xué)品有限公司； 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。線粒體探針MitoTrack green購(gòu)自Invitrogen公司。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自HyClone公司。人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所;MCF-7/ADR細(xì)胞(耐DOX細(xì)胞)購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育，每1~2 d更換1次培養(yǎng)液。

2方法

2.1地喹氯銨-阿霉素連接物(DQA-DOX)的合成DQA-DOX的合成路線如圖1所示。稱取60 mg 丁二酸酐加入到4 mL乙醇中，再依次加入73.3 mg 的DMAP和123.6 mg的 DCC，活化4~5 h，在上述溶液中加入158.1 mg DQA，再加入三乙胺(TEA)180 μL，室溫避光攪拌，TLC檢測(cè)。向反應(yīng)液中加入乙醇過濾，將濾液蒸干，得目標(biāo)產(chǎn)物地喹氯銨-琥珀酸酐連接物(DQA-SUC)240 mg。

將240 mg DQA-SUC用20 mL乙醇溶解，加入137 mg EDC，83 mg NHS，活化3 h。將100 mg 鹽酸阿霉素置于7 mL二氯甲烷中，加入100 μL三乙胺，室溫避光攪拌1 h，然后加入到DQA-SUC的乙醇溶液中，反應(yīng)12 h，TLC檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，過硅膠柱分離產(chǎn)物，得261.6 mg DQA-DOX。應(yīng)用1H NMR、MS等方法對(duì)合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1DQA-DOX的合成路線示意圖

Fig.1 Synthetic scheme of DQA-DOX

2.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將MCF-7/ADR和A549細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔6×103個(gè)細(xì)胞，體積200 μL)。12 h后，吸去培養(yǎng)液。將DOX和DQA-DOX用 RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋成50， 10， 5和1 μmol·L-1(均為折合阿霉素的濃度)加入培養(yǎng)板中(每孔200 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；隨后加入MTT溶液(5 mg·mL-1)20 μL，孵育4 h。吸棄培養(yǎng)液，再加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。

2.3caspase 3活性檢測(cè)caspase 3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。采用caspase 3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定caspase 3的活性。將MCF-7/ADR和A549細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，24 h后，吸棄培養(yǎng)液。將DOX和DQA-DOX用 RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋成10.0 μmol·L-1(均為折合阿霉素的濃度)加入到培養(yǎng)皿中，以加空白培養(yǎng)液為對(duì)照組。24 h后，按說明書處理細(xì)胞樣品。

2.4DQA-DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布將MCF-7/ADR細(xì)胞接種到含有蓋玻片的24孔板(0.5×106細(xì)胞/孔)，孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入10.0 μmol·L-1(均為折合阿霉素的濃度)DOX和DQA-DOX，孵育3 h。棄去培養(yǎng)液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次，每次5 min；加入500 μL DAPI (100 μg·mL-1)孵育15 min，棄去培養(yǎng)液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次；加入500 μL Mito Tracker (100 μmol·L-1)孵育1 h，棄去培養(yǎng)液，用37 ℃ pH7.4的PBS洗3次。加入1.5 g·mL-1多聚甲醛固定10 min。將蓋玻片倒置在載玻片上，采用共聚焦顯微鏡觀察。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1DQA-DOX的結(jié)構(gòu)表征DQA-DOX的高效液相色譜圖如圖2所示，測(cè)得DQA-DOX的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在99%以上。DQA-DOX的質(zhì)譜圖及核磁圖如圖3和圖4所示，DQA-DOX的分子離子峰([M+H])為1 087。以氘代DMSO為溶劑，在INOVA-400 MHz 型超導(dǎo)核磁共振儀獲得的DQA-DOX的特征1H NMR化學(xué)位移為8.2 (d, 2H), 7.9 (t, 2H), 7.7 (m, 1H), 6.2 (s, 2H), 5.3 (t, 2H), 4.9 (m, 1H), 4.7 (s, 6H), 3.8 (t, 3H), 3.1 (t, 2H), 2.9 (s, 6H), 2.1 (m, 4H), 1.7 (m, 4H), 1.2 (m, 16H), 1.0 (t, 3H)。

圖2DQA-DOX的高效液相色譜圖

Fig.2 The typical high performance liquid chromatogram of DQA-DOX

圖3DQA-DOX的質(zhì)譜圖

Fig.3 The mass spectrum of DQA-DOX

圖4DQA-DOX的核磁氫譜圖

Fig.41H NMR spectrum (dissolved in DMSO) of the DQA-DOX

3.2DQA-DOX的細(xì)胞毒性如圖5所示，與游離DOX相比，DQA-DOX對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。但是DQA-DOX對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯強(qiáng)于游離DOX。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，親脂性陽(yáng)離子三苯基溴化膦(triphenylphosphonium,TPP)可以選擇性地在線粒體聚集。當(dāng)TPP與DOX連接形成TPP-DOX時(shí)，與游離DOX相比，TPP-DOX對(duì)MDA-MB-435/DOX 細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但是TPP-DOX對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞的細(xì)胞毒性低于DOX[10]。

圖5DQA-DOX和DOX對(duì)A549細(xì)胞(A)和MCF-7/ADR細(xì)胞(B)的細(xì)胞毒性

注：與同濃度DOX組相比**P<0.01,*P<0.05

Fig.5 The cytotoxicity of free DOX and free DQA-DOX on A549 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B)

Note:**P<0.01,*P<0.05 vs free DOX at the same concentration

3.3DQA-DOX對(duì)腫瘤細(xì)胞caspase 3活性的影響研究表明，阿霉素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-12]。當(dāng)A549細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)不同濃度的DQA-DOX與DOX處理24 h后，用caspase 3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡。結(jié)果如圖6所示，與DOX相比，DQA-DOX誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用較弱；但DQA-DOX誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的作用較DOX明顯增強(qiáng)。

圖6DQA-DOX和DOX對(duì)A549細(xì)胞(A)和MCF-7/ADR細(xì)胞(B)caspase 3活性的影響

注：與同濃度DOX組相比**P<0.01,*P<0.05

Fig.6 The effect of DOX and DQA-DOX on caspase 3 activity in A549 cells (A) and MCF-7/ADR cells (B) in 24 h

Note:**P<0.01,*P<0.05 vs free DOX at the same concentration

3.4DQA-DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布通過激光共聚焦顯微鏡觀察DQA-DOX在腫瘤細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果如圖7所示，游離DOX與MCF-7/ADR細(xì)胞孵育后，阿霉素在細(xì)胞核內(nèi)分布得很少； DQA-DOX與MCF-7/ADR細(xì)胞孵育后，DQA-DOX主要分布在腫瘤細(xì)胞的線粒體。因此DQA-DOX可以誘導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖7DOX(A)與DQA-DOX(B)在MCF-7/ADR細(xì)胞中的分布

Fig.7 The distribution of DOX (A) and DQA-DOX (B) in MCF-7/ADR cells

4討論

在一些研究中，利用對(duì)線粒體有高親和力的親脂性陽(yáng)離子將抗腫瘤藥物遞送到腫瘤細(xì)胞線粒體來克服腫瘤的耐藥性[13-14]。遞送DOX到線粒體后可以通過不同機(jī)制引起細(xì)胞的死亡，例如:DOX引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)量的增加，也可以激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白(如caspase)，DOX還可作用于線粒體DNA或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ引起線粒體的損傷。因此，比通過將DOX遞送到線粒體有可能克服腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥。多藥耐藥機(jī)制包括像P糖蛋白的藥物泵作用，阻止藥物(例如DOX)在細(xì)胞的積累[15]。由于DQA強(qiáng)的疏水性與陽(yáng)離子特性，它可以很容易通過磷脂雙分子層，并且在帶負(fù)電性的線粒體基質(zhì)積累。正如期望的結(jié)果，DQA與DOX的連接物可以促進(jìn)DOX在線粒體的累積。盡管DOX沒有進(jìn)入細(xì)胞核，但是對(duì)耐DOX的MCF-7/ADR細(xì)胞依然顯現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

脂質(zhì)體作為藥物載體具有緩釋、低毒及組織靶向性等特點(diǎn)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，DQA可以固縮質(zhì)粒DNA自組裝形成DQAsomes，DQAsomes不僅可特異地將線粒體DNA運(yùn)送到線粒體，而且能夠保護(hù)質(zhì)粒DNA免于核糖核酸酶的降解，增加細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒DNA的攝取[17]。DQAsomes與模擬胞漿膜的脂質(zhì)作用時(shí)，不能釋放DNA，但與模擬線粒體膜且富含心磷脂的脂質(zhì)作用時(shí)，則可以釋放出DNA[18]。本文研究表明，DQA-DOX可特異蓄積于腫瘤細(xì)胞線粒體，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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