適度酒精預(yù)適應(yīng)對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

趙一龍，郭安臣，蘇芳，李巍巍，楊華俊，孫明，王擁軍1，2，3，，王群1，2，3，

缺血性卒中占卒中的60%～80%，具有高致殘、高致死的特點[1]。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)適量飲用紅葡萄酒可降低心腦血管疾病發(fā)病率[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)：在全腦缺血再灌注模型中，適量酒精在再灌注24 h前灌胃保護(hù)了隨后的腦缺血再灌注誘導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷[3]。故本研究提出以下假設(shè)：適度酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。本實驗利用局灶性腦缺血再灌注模型，從整體和組織水平闡明適度酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注損傷存在保護(hù)作用，為紅酒的適量飲用可產(chǎn)生腦預(yù)適應(yīng)保護(hù)，預(yù)防缺血性卒中提供理論證據(jù)，并提出“外源性適量酒精預(yù)適應(yīng)激活腦內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制”的概念。

1 對象與方法

1.1 研究對象和分組 采用雄性SD大鼠，體重320～350 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001]。36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌注組和酒精預(yù)適應(yīng)組，每組各12只。

缺血再灌注組和酒精預(yù)適應(yīng)組大鼠采用線栓法制作右側(cè)大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，缺血2 h，再灌注24 h。

酒精預(yù)適應(yīng)方法：酒精預(yù)適應(yīng)組在局灶性腦缺血再灌注前24 h用95%酒精（批號41322，sigma）與0.3 ml無菌蒸餾水混合后在非麻醉狀態(tài)下直接進(jìn)行灌胃，95%酒精體積（μl）計算為：[大鼠體重（g）×0.6]+0.3。其余兩組用同等體積的生理鹽水（批號11033042，天津藥業(yè)焦作有限公司）做同樣灌胃處理。每組各取8只大鼠在缺血再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分，然后麻醉處死取腦，行氯化2，3，5-三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色，比較各組的腦梗死體積。

每組剩余的4只大鼠，在缺血再灌注后24 h進(jìn)行小動物磁共振T2加權(quán)像（T2-weighted imaging，T2WI）序列掃描，觀察各組大鼠梗死體積的情況。然后將大鼠處死取腦，冷凍切片后，每只大鼠取第一軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的2張切片，1張用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2'-deoxyuridine 5'-triphosphate nick-end labeling，TUNEL）檢測其凋亡性細(xì)胞死亡情況，另一張用Fluoro-Jade B檢測其神經(jīng)元退化變性情況。

1.2 缺血再灌注模型制作方法 用5%異氟烷（河北一品制藥有限公司，京藥制字H19980141）通過氣體麻醉機(jī)對動物行氣體麻醉，以仰臥位放置在37℃恒溫板上。采用線栓法制作右側(cè)MCAO模型[4]。具體方法為，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)頸正中切口，暴露右側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈。線栓經(jīng)頸外動脈斷端進(jìn)入頸內(nèi)動脈，向內(nèi)延伸約20 mm直到感到抵觸感，此時線栓的頭部越過大腦中動脈的起始端，并阻斷大腦中動脈的血流。腦缺血2 h后線栓被拔出至頸外動脈的斷端，再灌注24 h。假手術(shù)組線栓在頸外動脈斷端處被結(jié)扎，不再向頸內(nèi)動脈延伸，其余手術(shù)過程與其他幾組相同。術(shù)后待大鼠清醒后，觀察大鼠是否有肢體屈曲或偏癱癥狀[5]。如果沒有，說明造模不成功。將造模失敗的大鼠去除，重新造模補(bǔ)充。

1.3 試驗方法

1.3.1 神經(jīng)功能行為評分 在局灶性腦缺血再灌注后24 h，采用Chen等[6]使用的行為評分方法，對各組動物進(jìn)行神經(jīng)功能評分（表1）。

1.3.2 TTC染色及梗死體積測量 局灶性腦缺血再灌注后24 h，動物按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛膠漿（北京天壇醫(yī)院制劑，京藥制字H20083287）麻醉后，斷頭處死。迅速取出腦組織，檢查并確定有無蛛網(wǎng)膜下腔出血。將每個腦組織切為2 mm厚的冠狀切片，共6片，在37℃水浴中與1%TTC（Sigma-Aldrich，美國）溶液避光孵育20 min，再于10%甲醛溶液中固定10 min。將TTC染色后的6張腦片照相后保存，以進(jìn)行損傷區(qū)域的測量。采用圖像分析系統(tǒng)（HMIAS-2000，北京空?？萍及l(fā)展公司）計算未被TTC染色的區(qū)域，即腦缺血損傷區(qū)域?？偣Ｋ荔w積的計算方法為6張腦片未染色的面積總和乘以腦片厚度。

1.3.3 磁共振檢查 局灶性腦缺血再灌注后24 h，動物以10%水合氯醛麻醉，應(yīng)用德國Bruker 7.0 T超高場實驗動物磁共振掃描儀進(jìn)行頭部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的T2WI序列平掃。掃描參數(shù)：重復(fù)時間/回?fù)軙r間（repetition time/echo time，TR/TE）=3140/37 ms；層厚1.0 mm。用圖像處理軟件（matlab，MathWorks，美國）計算出各組動物的梗死體積。

1.3.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 磁共振檢查后，將大鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，以4%多聚甲醛固定，后經(jīng)30%蔗糖溶液脫水，冷凍切片后用于TUNEL檢測和Fluoro-Jade B染色。

每只大鼠取第一軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的1張切片，使用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（No.11684817910，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，德國）進(jìn)行分析。25 μm厚的冠狀切片在冰上經(jīng)滲透液滲透后，在每個樣本上加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光反應(yīng)60 min。切片使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染后，熒光顯微鏡（DMI400B，Leica，德國）觀察。每張切片在梗死灶周邊區(qū)隨機(jī)選取5個高倍視野，每個高倍視野分別進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞和細(xì)胞核總數(shù)的計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果以每只大鼠的5個高倍視野TUNEL陽性細(xì)胞所占平均百分比進(jìn)行分析。

表1 大鼠腦損傷后神經(jīng)功能評分

1.3.5 Fluoro-Jade B染色檢測神經(jīng)元退化變性 每只大鼠取第一軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的1張切片，使用Fluoro-Jade B（Histo-Chem Inc.）染液進(jìn)行染色。25 μm厚的冠狀切片依次在包含1%氫氧化鈉的80%酒精、70%的酒精和0.06%的高錳酸鉀溶液中浸泡后，用Fluoro-Jade B染液染色。經(jīng)蒸餾水沖洗后，使用DAPI復(fù)染。然后放在50℃烘干機(jī)里烘干，經(jīng)二甲苯浸泡后，熒光顯微鏡（DMI400B，Leica，德國）觀察。每張切片在梗死灶周邊區(qū)隨機(jī)選取5個高倍視野，每個高倍視野分別進(jìn)行Fluoro-Jade B陽性細(xì)胞和細(xì)胞核總數(shù)的計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果以每只大鼠的5個高倍視野Fluoro-Jade B陽性細(xì)胞所占平均百分比進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，神經(jīng)功能行為評分的數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，其他數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。神經(jīng)功能行為評分的數(shù)據(jù)用Kruskal-Wallis檢驗分析，其余各組之間比較采用單因素方差分析及Tukey檢驗。P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TTC染色所示適度酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 TTC染色顯示：酒精預(yù)適應(yīng)組的梗死體積較缺血再灌注組顯著減少[（54.83±13.43）mm3vs（242.80±17.44）mm3，P＜0.001）（圖1）。

2.2 適度酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損的影響 3組大鼠在局灶性腦缺血再灌注后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分顯示：3組大鼠的神經(jīng)功能評分之間差異有顯著性（KW=19.28，P＜0.001）。缺血再灌注組的神經(jīng)功能缺損較假手術(shù)組顯著加重（P＜0.001），酒精預(yù)適應(yīng)組的神經(jīng)功能缺損較缺血再灌注組減輕（P＜0.05），酒精預(yù)適應(yīng)組的神經(jīng)功能缺損較假手術(shù)組差異無顯著性（表2）。

2.3 磁共振成像所示酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 3組大鼠在局灶性腦缺血再灌注后24 h進(jìn)行頭部MRI的T2WI序列平掃，結(jié)果顯示：酒精預(yù)適應(yīng)組的梗死體積較缺血再灌注組明顯減少[（59.68±9.97）mm3vs（296.80±8.53）mm3，P＜0.001]（圖2）。

圖1 大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織TTC染色圖

2.4 酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響 在缺血再灌注組大鼠的右側(cè)軀體感覺皮質(zhì)區(qū)可見大量綠色的TUNEL染色陽性細(xì)胞，而通過適度酒精預(yù)適應(yīng)后TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，假手術(shù)組TUNEL染色為陰性（圖3）。3組大鼠的凋亡陽性細(xì)胞計數(shù)值差異有顯著性（F=143.3，P＜0.001，表3）。缺血再灌注組的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.001），酒精預(yù)適應(yīng)組的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較缺血再灌注組顯著減少（P＜0.001），酒精預(yù)適應(yīng)組的TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.001）。

2.5 酒精預(yù)適應(yīng)對局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)元退化變性的影響 在缺血再灌注組大鼠的右側(cè)軀體感覺皮質(zhì)區(qū)可見大量綠色的Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞，而通過適度酒精預(yù)適應(yīng)后Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，假手術(shù)組Fluoro-Jade B染色為陰性（圖4）。3組大鼠的凋亡陽性細(xì)胞計數(shù)值差異有顯著性（F=105.4，P＜0.001，表4）。缺血再灌注組的Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.001），酒精預(yù)適應(yīng)組的Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較缺血再灌注組顯著減少（P＜0.001），酒精預(yù)適應(yīng)組的Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.001）。

表2 酒精預(yù)適對大鼠神經(jīng)功能影響

圖2 大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織磁共振成像T2WI圖

圖3 大鼠局灶性腦缺血再灌注后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的DAPI染色陽性細(xì)胞、TUNEL染色陽性細(xì)胞及TUNEL染色陽性細(xì)胞所占百分比圖(200×)

表3 TUNEL染色所示酒精預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞凋亡的影響

表4 Fluoro-Jade B染色所示酒精預(yù)適應(yīng)對神經(jīng)元退化變性的影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷會導(dǎo)致高死亡率和長期嚴(yán)重的生理和認(rèn)知障礙[7]。其中，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷中的關(guān)鍵，這是因為其強(qiáng)大的氧化和還原作用，可以消耗抗氧化劑，抵制內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，干擾能量代謝以及導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，適度酒精預(yù)適應(yīng)對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與酒精誘導(dǎo)了還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）形成ROS有關(guān)，這可能是因為適度酒精預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)了微量ROS的形成，產(chǎn)生了適度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。而且，在腎中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[9]。因此，ROS對機(jī)體來說可能是一把雙刃劍。除此之外，有文章報道適度酒精能誘導(dǎo)N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）[10]或者γ-氨基丁受體（γ－aminobutyric acid，GABA）[11]的激活，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，但是確切的機(jī)制仍待研究。

圖4 大鼠局灶性腦缺血再灌注后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的DAPI染色陽性細(xì)胞、Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞及Fluoro-Jade B染色陽性細(xì)胞所占百分比圖(200×)

缺血性卒中由于病因、病程、梗死部位、缺血程度及合并系統(tǒng)疾病的差異，導(dǎo)致臨床變異性很大。目前臨床上缺血性卒中的治療主要集中在溶栓和神經(jīng)保護(hù)方面[12]。而溶栓由于其時間窗很短，只有3～4.5 h[13]，因此能得到治療的患者是非常有限的。至于外源性神經(jīng)保護(hù)劑，盡管許多藥物在動物模型上顯示了神經(jīng)保護(hù)作用，然而在從動物到臨床的轉(zhuǎn)化研究中未能顯示同樣的效果[14]。因此，目前越來越多的研究集中在內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)方面，比如預(yù)適應(yīng)[15]。

預(yù)適應(yīng)是這樣一種現(xiàn)象：短暫的亞致死損害會為隨后發(fā)生的致死損傷提供強(qiáng)力的保護(hù)作用，它被認(rèn)為是自然界中的一種常規(guī)形式[15]。預(yù)適應(yīng)中最經(jīng)典的是缺血預(yù)適應(yīng)，已在多種器官中發(fā)現(xiàn)[16-17]。但是，由于缺血預(yù)適應(yīng)在機(jī)體中難以實現(xiàn)，人們正熱衷于尋找合適的藥物來代替。

流行病學(xué)研究結(jié)果表明，低至中等劑量的紅酒攝入能降低心肌梗死與卒中的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，這可能與紅酒中含有的酒精有關(guān)[18]。適度酒精預(yù)適應(yīng)是預(yù)適應(yīng)的一種，是指先期攝入低至中等劑量的酒精，可保護(hù)組織免受隨后的缺血/再灌注造成的損傷。要產(chǎn)生這一保護(hù)作用，需要血漿中的酒精濃度在短時間內(nèi)（30～60 min）增加到10 mmol，這相當(dāng)于人飲用1～2杯酒精飲料的水平。本研究在大鼠腦缺血再灌注前24 h灌胃95%酒精，這樣，血漿中的酒精濃度在灌胃后30 min增加到45 mg/dl的峰值，從而產(chǎn)生保護(hù)作用[19]。

已有研究表明，在腦缺血再灌注的動物模型中，適度酒精預(yù)適應(yīng)可減輕大腦的梗死面積[20]。在本研究中，局灶性腦缺血再灌注后24 h腦組織TTC染色也得出了同樣的結(jié)果。同時，T2WI圖像結(jié)果從另一方面證明適度酒精預(yù)適應(yīng)可減小局灶性腦缺血再灌注后的梗死體積。

有研究表明，適度酒精預(yù)適應(yīng)能明顯減輕大鼠全腦缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元退化變性[21]。在本研究中，TUNEL染色和Fluoro-Jade B染色的結(jié)果表明，適度酒精預(yù)適應(yīng)能明顯減輕大鼠局灶性缺血再灌注后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元退化變性，提示酒精對腦缺血再灌注的保護(hù)作用可能介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元退化變性途徑，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。

需要指出的是，雖然本研究表明適量的酒精攝入會對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，但作為動物實驗存在向臨床實際效果轉(zhuǎn)化的問題，而且本研究沒有對酒精預(yù)適應(yīng)對大鼠缺血再灌注長期神經(jīng)功能影響進(jìn)行研究。目前，酒精的預(yù)保護(hù)作用的確切機(jī)制尚不清楚，需要再進(jìn)行大量的研究來探討；酒精預(yù)適應(yīng)對細(xì)胞凋亡的影響究竟是抑制細(xì)胞凋亡還是延緩了凋亡的發(fā)生，這需要大鼠腦缺血后觀察至7 d的實驗來驗證；另外，酒精預(yù)適應(yīng)對腦缺血后細(xì)胞凋亡的時間效應(yīng)作用也有待完善。

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