煙草種子的老化規(guī)律研究

禹曉梅，馬文廣，2，鄭昀曄，2

（1．玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪653100；2．云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪653100）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的好壞直接影響到播種品質(zhì)。種子質(zhì)量是種子潛力的綜合表現(xiàn)，種子具有優(yōu)良品質(zhì)是保證快速發(fā)芽、出苗整齊和健壯的先決條件［1］。種子活力是種子質(zhì)量最重要的指標(biāo)，它是指種子在發(fā)芽和出苗期間的活性強(qiáng)度及特性的綜合表現(xiàn)。高活力種子發(fā)芽早、出苗整齊迅速，抵抗不良環(huán)境的能力強(qiáng)，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力；低活力種子在適宜的條件下雖然能發(fā)芽，但是發(fā)芽緩慢，在不良環(huán)境條件下出苗不整齊，甚至不出苗。種子從形成發(fā)育直到成熟脫離母株，每時(shí)每刻都受到外界環(huán)境條件的影響。當(dāng)種子達(dá)到生理成熟干重增至最大時(shí)，種子具有最高的活力，此后隨著種子不停的衰老向著死亡推移，活力逐漸下降，即發(fā)生種子老化（seed aging）。Gove［2］將種子老化定義為：種子的品質(zhì)及其性能或生活力從較高水平下降至較低的水平。

煙草種質(zhì)主要以種子的形式進(jìn)行低溫低濕保存，低溫保存會(huì)延長(zhǎng)儲(chǔ)存壽命，但不能阻止老化［3－4］。種子老化劣變直接影響到種子的活力，從而對(duì)種子田間的出苗能力造成極其嚴(yán)重的影響，最終導(dǎo)致減產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。種子老化也會(huì)引起遺傳完整性的改變，老化到一定程度需要繁殖更新。

種子老化導(dǎo)致種子活力下降的機(jī)制非常復(fù)雜，其實(shí)質(zhì)在于細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理功能上發(fā)生的一系列變化［5－9］。人工加速老化和自然老化方法是研究種子老化過(guò)程中生理生化變化、種子活力變化及種子耐藏性等常用的兩種方法。由于自然老化過(guò)程緩慢，所需的時(shí)間很長(zhǎng)，難以獲得試驗(yàn)材料等因素，所以在科學(xué)研究中一般很少采用這種方法。而人工加速老化能夠克服自然老化所需時(shí)間長(zhǎng)的不足，容易在較短的時(shí)間內(nèi)獲得不同活力的種子材料，因而廣泛應(yīng)用于種子老化機(jī)理的研究。大量研究表明，利用人工老化法使種子活力迅速喪失，只是加速了種子內(nèi)部的代謝過(guò)程，并無(wú)老化機(jī)理上的差異。因此，人工老化法可以模擬種子的自然老化和劣變過(guò)程［10－13］。

本實(shí)驗(yàn)采用高溫高濕加速老化方法，旨在研究不同老化溫度和時(shí)間對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響以及種子老化過(guò)程中抗氧化酶的變化規(guī)律，為探討煙草種子老化特性和機(jī)理提供理論參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用烤煙品種云煙97為研究對(duì)象，進(jìn)行人工老化實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 煙草種子吸濕等溫曲線

將煙草種子放在分別含有不同溶度LiCl溶液的環(huán)境中，相對(duì)濕度為18%、33%、44%、60%、85%和100%的密閉瓶子中，放置于控溫房中（20±1）℃使其平衡大概4周的時(shí)間，直到種子的水勢(shì)穩(wěn)定。種子含水量的計(jì)算是基于鮮重進(jìn)行。種子的干重通過(guò)在烘箱中105℃，17h后獲得，含水量按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

公式（1）：含水量（%）＝（鮮重－干重）／鮮重×100%。

2．2 人工加速老化測(cè)定溫度和時(shí)間的設(shè)置

將種子分別置于39，41，43，45℃下，濕度為100%的環(huán)境中進(jìn)行人工加速老化處理，并在每個(gè)溫度環(huán)境下對(duì)供試種子分別老化24，36，48，60，72，84，96h，以未處理種子為對(duì)照。

2．3 種子活力測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)按照國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程（ISTA）規(guī)定條件進(jìn)行，取兩層濾紙平展在直徑為9cm的玻璃培養(yǎng)皿中并充分吸水，將不同老化天數(shù)種子和對(duì)照分別均勻擺放在濾紙上，每皿100粒，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)，溫度25℃，3次重復(fù)，各處理每日分別加入適量的蒸餾水以保證正常生長(zhǎng)。5d測(cè)定種子發(fā)芽勢(shì)，14d統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和幼苗干重（幼苗在105℃烘箱中殺青15min，90℃烘干17h后稱(chēng)重為幼苗干重），萌發(fā)定義為子葉變綠。種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)按下列公式（2），（3）計(jì)算：

公式（2）：發(fā)芽指數(shù)＝∑（Gt／Dt），式中Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

公式（3）：種子活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×幼苗干重（mg）。

2．4 種子浸提液相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

分別稱(chēng)取不同老化時(shí)間的種子材料，3次重復(fù)，用去離子水沖洗2遍，加入20mL去離子水，在20℃恒溫條件下浸種3h，然后用DDS－11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定煮沸前浸出液電導(dǎo)率，再煮沸10min，冷卻至室溫時(shí)測(cè)定煮沸電導(dǎo)率。

公式（4）：相對(duì)電導(dǎo)率（%）＝煮沸前浸出液電導(dǎo)率／煮沸電導(dǎo)率×100%。

2．5 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

稱(chēng)取0．2～0．5g種子中加入2mL 10%三氯乙酸（thichloroacetic acid，TCA）研磨提取2min；提取液轉(zhuǎn)入離心管，用3mL 10%TCA分3次沖洗研缽（1mL／次），沖洗液與提取液合并；10 000×g離心15 min，取上清液，用10%的TCA 溶液定容至5mL；取1mL上清液，加入1mL 0．6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），100℃水浴加熱20min，迅速冷卻；10 000×g離心10min，取上清液在532，600，450 nm測(cè)定吸光值（Abs）。

MDA含量計(jì)算：公式（5）：樣品提取液中MDA的濃度（c）＝6．45×（A532－A600）－0．56×A450（試中：樣品中MDA的質(zhì)量摩爾濃度（μmol／L）＝C×N／W 。

C為 MDA 濃度（μmol／L），N 為提取液體積（L），W 為組織的干重（g）。

2．6 3種抗氧化酶（POD、SOD、CAT）的提取方法與測(cè)定

稱(chēng)取0．2g材料，加入預(yù)冷的提取液3mL，充分冰浴研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL提取液沖洗研缽，于4℃下20 000×g離心20min，分裝上清液，于液氮冷凍后在－80℃超低溫冰箱保存，待測(cè)。酶提取系統(tǒng)配方為50mmol／L Tris－HCl緩沖液，pH＝7．0，內(nèi)含20%甘油，1mmol／L EDTA，1mmol／L AsA，1mmol／L DTT，1mmol／L GSH，5mmol／L MgCl2，配好后于4℃冰箱保存。

超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定，以O(shè)D560變化0．5為一個(gè)酶活單位（U）；過(guò)氧化物酶（POD）的測(cè)定參照愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘OD470變化0．01為一個(gè)酶活單位（U）；過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定，以每分鐘OD240變化0．1為一個(gè)酶活單位（U）。

2．7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SAS軟件（8．0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD，α＝0．05，百分率數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換（y＝arcsin［sqr（x／100）］）。

3 結(jié)果與分析

3．1 煙草種子吸濕等溫曲線

種子壽命的外界因素主要有3個(gè)，即濕度（水分）、溫度和空氣含氧量，這3個(gè)因素中以水分最為重要。本試驗(yàn)研究了在不同空氣相對(duì)濕度下煙草種子吸濕平衡含水率，得出了煙草種子的吸濕等溫曲線（圖1）。種子吸濕等溫曲線與種子化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)及溫度有關(guān)。煙草種子顯示了典型的油料作物種子的吸濕等溫曲線特征。空氣濕度為18%時(shí)種子含水量為4%，空氣濕度為33%種子含水量為5%，空氣濕度為100%時(shí)種子含水量為25%。煙草種子含水量越低，種子儲(chǔ)藏時(shí)間越長(zhǎng)，一般煙草種子安全含水量為5%左右。煙草種子吸濕等溫曲線可以為煙草種子在室內(nèi)儲(chǔ)藏以及包裝袋內(nèi)儲(chǔ)藏的壽命研究提供理論依據(jù)。

圖1 煙草種子的吸濕等溫曲線

3．2 不同老化溫度處理對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響

經(jīng)過(guò)不同老化溫度處理后測(cè)定結(jié)果顯示（圖2），煙草種子云煙97在各溫度下隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)萌發(fā)率均下降，但是下降率不同。云煙97種子在30，35℃和38℃下老化96h后萌發(fā)率下降10%～20%左右，但是40℃老化72h后萌發(fā)率開(kāi)始大幅下降，96h后萌發(fā)率顯著下降至17%。因此，經(jīng)過(guò)不同溫度的老化處理均能夠降低種子的發(fā)芽率，但是較低溫度處理對(duì)萌發(fā)率高的種子老化效果不明顯，而較高溫度老化卻可導(dǎo)致種子萌發(fā)率的迅速下降。因此，根據(jù)不同溫度、不同時(shí)間對(duì)煙草種子老化情況，表明40℃和72h的老化處理組合可以將不同發(fā)芽能力的種子明顯分開(kāi)，是煙草種子人工加速老化處理的適宜條件。

圖2 不同老化溫度處理對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響

3．3 人工老化處理對(duì)煙草種子活力的影響

云煙97在40℃老化不同時(shí)間后的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)見(jiàn)表1。經(jīng)人工老化處理后，隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈降低趨勢(shì)。在老化進(jìn)程中，除種子發(fā)芽率在老化24h時(shí)與對(duì)照差異不顯著外，老化24h后，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著下降，且以發(fā)芽勢(shì)的降幅最大。如人工老化48h時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)則迅速下降，發(fā)芽勢(shì)由對(duì)照99%下降到82%，變化率分別為17%；活力指數(shù)由對(duì)照20．55下降到13．57，變化率分別為33%；發(fā)芽指數(shù)由對(duì)照的9．48下降為6．47，變化率32%。隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的生理老化程度加深，表現(xiàn)為發(fā)芽速度減慢，種子的發(fā)芽率降低和種子的活力顯著下降。

表1 人工老化過(guò)程中煙草種子活力的變化

3．4 人工老化過(guò)程中煙草種子抗氧化酶活性及膜質(zhì)過(guò)氧化的變化

云煙97在40℃和100%RH相對(duì)濕度的環(huán)境中，經(jīng)不同時(shí)間老化處理后，過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在種子老化過(guò)程中，云煙97種子中的過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，并且在老化后期72h和96h下降較快。隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，云煙97的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)，在老化72h和96h時(shí)上升較快。膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的變化趨勢(shì)與相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致，從24h至96h呈上升趨勢(shì)，且上升幅度越來(lái)越大，特別是72h至96h時(shí) MDA含量上升最快。表明煙草種子在人工老化過(guò)程中，隨著POD、SOD、CAT等抗氧化物酶活性的降低，脂質(zhì)和膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，造成MDA有害物質(zhì)的累積及膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，透性增大，導(dǎo)致種子細(xì)胞內(nèi)的礦物質(zhì)和一些無(wú)機(jī)物質(zhì)迅速外滲，電導(dǎo)率升高，并且隨著種子老化程度加劇，這種趨勢(shì)愈來(lái)愈明顯。

表2 人工老化過(guò)程中煙草種子抗氧化酶活性及膜質(zhì)過(guò)氧化的變化

4 總 結(jié)

試驗(yàn)以煙草種子云煙97為研究材料，人工加速老化的處理過(guò)程中，溫度、時(shí)間對(duì)種子老化有重要的影響。表明40℃和72h的老化處理組合可以將不同發(fā)芽能力的種子明顯分開(kāi)，是煙草種子人工加速老化處理的適宜條件。

一般認(rèn)為，衰老種子在死亡之前，其內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列生理生化劣變，包括種子組成成分和酶活性的變化，有毒物質(zhì)的積累，合成及修復(fù)能力的降低等，并且隨著老化程度的加深，這些變化會(huì)越來(lái)越明顯，最終導(dǎo)致種子不可逆轉(zhuǎn)性死亡。種子內(nèi)存在SOD、CAT、POD等抗氧化酶，其作為酶促抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分發(fā)揮協(xié)同作用，共同清除活性氧物質(zhì)，使活性氧維持在一個(gè)對(duì)細(xì)胞無(wú)害的穩(wěn)定狀態(tài)。種子老化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物具有很強(qiáng)的毒害作用，可以啟動(dòng)膜脂中不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用，產(chǎn)生O2－，使細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致種子老化和組織衰老。MDA是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低可以用來(lái)衡量植物在逆境脅迫下生物膜受活性氧傷害程度的大小。種子劣變過(guò)程中，脂質(zhì)過(guò)氧化，膜透性增加，溶質(zhì)外滲，合成能力下降，激素也發(fā)生相應(yīng)的變化，SOD、CAT、POD等保護(hù)性酶的活性降低，清除自由基及過(guò)氧化物的能力減弱，自由基不斷積累，攻擊膜磷脂分子的不飽和脂肪酸，膜受到破壞，透性增大，積累MDA等有毒物質(zhì)，造成種子活力下降。本研究結(jié)果表明，隨著種子老化程度的加深，煙草種子SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性下降，MDA含量升高，種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率也顯著增加。這與前人對(duì)大豆、小麥、玉米、辣椒、大白菜、白菜研究結(jié)果相一致，表明煙草種子人工老化及劣變的主要機(jī)制也在于膜脂過(guò)氧化作用加劇。

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